Применение новых молекулярно-биологических технологий для выявления Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью

• Автор: Скотникова, Ольга Ивановна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 215 с. : ил.

1.1.Введени е

1 .2.Молекулярногенетические основы резистентности

i i к изониазиду

1.3 .Молекулярные механизмы устойчивости i i к рифампицину.

1.4.Генотипирование штаммов i i

по ДНК.
1.5.Культуральные и молекулярные методы диагностики чувствительности i i к противотуберкулезным препаратам.

1.5.1.Фенотипические методы диагностики

1.5.1.1.Определение чувствительности i i

к противотуберкулезным препаратам на плотных сре

1.5.1.2.Определение чувствительности i i

к противотуберкулезным препаратам на жидких сре
1.5.1.3. Анализ чувствительности i i к
противотуберкулезным препаратам с помощью бактериофагоъРИа Ванализ.
1.5.2.Молекулярногенетические методы определения чувствительности i i к противотуберкулезным препаратам.
1.5.2.1.Методы пробоподготовки биологических образцов и выделения ДНК i i.
1.5.2.2.Методы детекции мутаций, ассоциированных с лекарственной устойчивостью.
Глава 2. Материалы и методы
2.1 .Обследованные пациенты
2.2.Культуры i i, выделенные
от больных туберкулезом
2.3.Методы исследования
2.3.1 .Определение лекарственной чувствительности i i к рифампицину и изониазиду
бактериологическими методами.
2.3.2.Обработка клинического материала для молекулярных исследований.
2.3.3.Выделение ДНК i i из диагностического материала.
2. ЗАПодбор праймеров.
2.3.5.Определение ДНК i i.
2.3.5.1 .Реакция амплификации
2.3.5.2.Регистрация и анализ продуктов амплификации
2.3.6. Проверка специфичности полимеразной цепной реакции .
2.3.7. Выявление мутаций в гене i i методом гетеродуплексного анализа
2.3.7.1 .Получение универсального гетеродуплексного генератора
2.3.8. Прямое секвенирование ПЦРфрагментов
2.3.9. Определение чувствительности i i к рифампицину с помощью биологических микрочипов ТББИОЧИПРИФ.
2.3Метод конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов .
2Определение мутаций в генах, ответственных за резистентность к изониазиду , x, i,
2.3 Выявление микобактерий резистентных к рифампицину и изониазиду с помощью биологических микрочипов ТББИОЧИП.
2.3Статистическая обработка
Глава 3. Собственные исследования
3.1. Методические подходы применяемые для повышения эффективности выделения ДНК i
i и определения ее лекарственной чувствительности.
3.1.1 .Забор образцов
3.1.2.робоподготовка.
3.1.3 .Выделение ДНК
3.1.4.0пределение i i в зависимости от формы туберкулеза и стадии туберкулезного процес
3.2.0пределение лекарственной чувствительности
i i к рифампицину методом гетеродуплексного анализа.
3.3.Определение чувствительности i
i к рифампицину с помощью биологических микрочипов ТББИОЧИПРИФ
3.4.Определение чувствительности i i к изониазиду методом конформационного
полиморфизма одноцепочечных фрагментов
3.5 .Определение лекарственной устойчивости
i i к рифампицину и изониазиду методом биологических микрочипов ТББИОЧИП.
Заключение.
Выводы.
Список литературы


МВТ отличаются от других бактерий тем, что очень большая часть кодирующей способности посвящена продукции ферментов, участвующих в липогенезе и липолизе . Р., . Изучен ряд последовательностей, которые применяются для идентификации как МВТ, так и микобактериального комплекса. Последовательности элемента 0 наиболее часто применяются для выявления ДНК, и в качестве маркера при изучении эпидемиологии туберкулеза, хотя могут и не . Однокопийные последовательности 7 и также применяются для диагностики туберкулеза i . Известен ген , ответственный за рост МВТ в фагоцитарных вакуолях макрофагов i Р. Изучен ген i играющий важную роль в координации механизмов вирулентности на разных стадиях заболевания i . Считается, что только для ,0 генов генома МВТ известно участие в биохимических процессах клетки. Роль остальных генов или предположительна, как для семейства гена v7 считается, что их функция связана с формированием клеточной стенки . Вместе с тем, некоторые процессы резистентность к И и этионамиду регулируются одним геном i еноилАСПредуктаза, а именно, его регуляторной областью, фланкирующим сайтом, ответственным за связь с рибосомами . РИ . Другой особенностью генома МБТ, является наличие взаимосвязи в работе нескольких генов А и О. I., x . Известно, что РИ определяется, в основном, генами , i, , x, а в последние годы исследователи показали, что мутации в генах , v2, v2, v, ii также приводят к резистентности к этому препарату . Установлено, что различные противотуберкулезные препараты ПТП действуют на разные мишени, что обусловлено особенностями механизма их действия и местом приложения этого действия. Так, Р и хинолоны оказывают ингибирующее влияние на синтез нуклеиновых кислот, для Р мишенью является субъединица фермента РНКполимеразы, для фторхинолонов ДНКгиразы. И, этамбутол и этионамид тормозят синтез клеточной стенки микобактерий за счет изменения активности некоторых ферментов каталазыпероксидазы, кодируемой геном еноилредуктазы, кодируемой геном i алкилгидропероксидредуктазы, кодируемой геном . Ген кодирует работу фермента 3кетоацилпротеинсинтетазы. Стрептомицин тормозит синтез белков, и основными мишенями являются рибосомный белок и i . У микобактерий существуют и другие общие для всех бактерий механизмы формирования лекарственной устойчивости ЛУ. К ним относятся мутации в ферментах, которые активируют антимикробный препарат увеличение количества копий мишени за счет амплификации кодирующего ее гена инактивация антибиотика путем ферментативного расщепления транспортные барьеры, препятствующие проникновению антибиотика в клетку и т. Р., . ПТП, развитии лекарственной устойчивости, особенно множественной, определяющейся как сочетанная РР и РИ, независимо от наличия или отсутствия устойчивости к другим препаратам. Изониазид является одним из наиболее действенных ПТП первого ряда, обладает эксклюзивной активностью в отношении МВТ . Процесс перехода И в активную форму в организме человека многоступенчатый, основым моментом является окисление И с помощью каталазыпероксидазы. В настоящее время в геноме МВТ идентифицировано четыре основных гена, мутации в которых приводят к изменениям ряда метаболических процессов, определяющих развитие резистентности МВТ к И. Ген занимает п. И внутри микобактериальной клетке . За счет снижения каталазной активности до , может быть утрачена функция активации этого препарата, в результате чего микобактерии приобретают РИ. Подтверждением этого механизма являются эксперименты по искусственному введению гена, контролирующего синтез каталазы из устойчивых штаммов МВТ в чувствительные, что превращало микобактерии в резистентную форму. Каталазапероксидаза принимает участие и в накоплении окисленных производных И, особенно изоникотиновой кислоты, участвуя в регуляции кислородного взрыва . Поскольку ген был выявлен первым, то, повидимому, и мутаций в этом гене открыто больше, чем в других генах, ответственных за РИ. По литературным данным таких мутаций более . Они располагаются примерно в 8 кодонах исследуемого участка гена.