Свойства хитиназы Bacillus sp. 739 - антагониста фитопатогенных грибов

• Автор: Актуганов, Глеб Эдуардович
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Уфа
• Количество страниц: 107 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Реакции, катализируемые хитиназами.

1.2. Распространение и роль хитиназ в природе

1.3. Бактериальные продуценты хитиназ

1.3.1.риродные источники продуцентов хитиназ

1.3.2. Питательные среды и особенности биосинтеза хитиназы

у видов i

1.4. Выделение и свойства бактериальных хитиназ

1.4.1. Способы выделения и очистки бактериальных хитиназ
1.4.2. Специфичность и механизм действия хитиназ бактерий рода i
1.4.3. Молекулярные характеристики хитиназ
1.5. Проблема применения бактерий, образующих хитинолитичсские ферменты, для защиты сельскохозяйственных растений от болезней, вызываемых фитопатогенными грибами.
2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
2.1. Объекты исследований
2.2. Микробиологические методы.
2.2.1. Условия поддержания и культивирования штамма i . 9.
2.2.2. Условия поддержания и культивирования фитопатогенных грибов
2.2.3. Изучение влияния условий культивирования на биосинтез хитиназы i .
2.3. Физикохимические и биохимические методы
2.3.1. Полу чение коллоидного хитина.
2.3.2. Получение коллоидного хитозана
2.3.3. Получение других источников углерода
2.3.4. Измерение хитнназной активности.
2.3.5. Определение ацетилглюкозаминидазной активности
2.3.6. Измерение хитозаназной активности.
2.3.7. Измерение МДглюканазной активности
2.3.8. Определение концентрации белка
2.3.9. Основные этапы выделения и очистки хитиназы
i . 9.
2.3Изучение профиля и стабильности очищенной хитиназы.
2.3 Определение температурного оптимума и термостабильности препарата очищенной хитиназы
2.3 Изучение влияния на термостабильность хитиназы i . 9.
2.3 Гельэлектрофорез в денатурирующих условиях
2.4. Методы изучения антигрибной и миколитической активности
хитиназы i .
2.5. Статистическая обработка результатов.
3. ОБРАЗОВАНИЕ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ХИТИНАЗЫ КУЛЬТУРОЙ
I .
3.1. Динамика процессов роста и секреции хитиназы i . 9.
3.2. Влияние источников углерода на биосинтез
хитиназы i .
3.2.1. Природа источника углерода
3.2.2. Влияние концентрации хитина в среде.
3.2.3. Дополнительные источники углерода.
3.3. Источники азота и их влияние на выход хитиназы
i . 9.
3.4. Влияние начального среды и температуры культивирования
на образование хитиназы i . 9.
4. ОЧИСТКА И ХАРАКТЕРИСТИКА ХИТИНАЗЫ I . 9.
4.1. Очистка хитиназы i .
4.2. Свойства хитиназы i . 9.
4.2.1 Характеристика физикохимических свойств препарата
очищенной хитиназы i . 9.
4.2.2. Субстратная специфичность и механизм действия хитиназы i .
4.2.3. Характер действия очищенной хитиназы i .
на основной субстрат
5. АНТИГРИБНАЯ АКТИВНОСТЬ ХИТИНАЗЫ I . 9.
5.1. Антигрибное действие препаратов хитиназы i .
в агаризованной питательной среде
5.2. Влияние хитиназы на прорастание спор
фитопатогенных грибов
5.3. Влияние хитиназы i . 9 на радиальный рост
колоний микромицетов.
5.4. Лизирующее действие хитиназы на грибной мицелий
5.4.1. Визуальное наблюдение лизиса грибного мицелия.
5.4.2. Образование редуцирующих сахаров в процессе литического действия хитиназы на мицелий грибов
5.4.3. Изменение массы сухого вещества грибов в результате инкубации с хитимазой i . 9.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
ВВЕДЕНИЕ
К настоящему времени накоплен достаточно обширный материал о ферментах, гидролизующих хитин. При этом основная масса научных публикаций приходится на последние десятилетия. Интенсивные исследования хитиназ обусловлены, как минимум, двумя причинами. В первую очередь интерес вызывает проблема ферментативного гидролиза хитина и хитозана, поскольку в последнее время все более широкое практическое применение находят растворимые олигосахариды данных полимеров 8, 9, . К тому же, механизм естественной ферментативной конверсии этого нерастворимого полисахарида в легкодоступные продукты является интересной теоретической проблемой . Вовторых, в хитинолитических фермегтах и продуцирующих их микроорганизмах многие исследователи видят естественное и эффективное средство борьбы с разнообразными паразитическими грибами и беспозвоночными, у которых хитин является важным структурным компонентом клеточной стенки и экзоскелета , .
Актуальность


АНТИГРИБНАЯ АКТИВНОСТЬ ХИТИНАЗЫ I . Антигрибное действие препаратов хитиназы i . Влияние хитиназы i . Визуальное наблюдение лизиса грибного мицелия. Изменение массы сухого вещества грибов в результате инкубации с хитимазой i . ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. К настоящему времени накоплен достаточно обширный материал о ферментах, гидролизующих хитин. При этом основная масса научных публикаций приходится на последние десятилетия. Интенсивные исследования хитиназ обусловлены, как минимум, двумя причинами. В первую очередь интерес вызывает проблема ферментативного гидролиза хитина и хитозана, поскольку в последнее время все более широкое практическое применение находят растворимые олигосахариды данных полимеров 8, 9, . К тому же, механизм естественной ферментативной конверсии этого нерастворимого полисахарида в легкодоступные продукты является интересной теоретической проблемой . Вовторых, в хитинолитических фермегтах и продуцирующих их микроорганизмах многие исследователи видят естественное и эффективное средство борьбы с разнообразными паразитическими грибами и беспозвоночными, у которых хитин является важным структурным компонентом клеточной стенки и экзоскелета , . Актуальность темы. Бактериальные продуценты хитиназ, в том числе и аэробные спорообразующие бактерии, находят все более широкое применение как биологическая основа препаратов для защиты сельскохозяйственных растений от болезней 7, , 3. Считается, что антагонизм бактерий рода i ко многим микроскопическим грибам обусловлен в первую очередь синтезом соединений антибиотической природы , . Вместе с тем, доказано и участие комплекса литичсских ферментов, продуцируемых антагонистами, в разрушении клеточной стенки мицслиальных грибов , 6. Важнейшими в этом комплексе ферментов являются хитиназы. Однако, в отличие от других микроорганизмов, бациллы и роль хитиназы в их антагонизме к грибам изучены недостаточно. Цель работы. Бациспсцин БМ , выяснить роль образуемой им хитиназы в антагонизме i . В связи с этим, было необходимо более детально изучить свойства хитиназы i . Другим направлением работы являлось изучение условий максимальной продукции хитиназы штаммом i . Изучить влияние условий культивирования на секрецию хигиназного комплекса музейным штаммом i . Провести очистку хитиназы, преобладающей в культуральной жидкости исследуемого штамма. Исследовать физикохимические и биохимические свойства очищенного ферме1гга. Изучить воздействие препаратов сырой и очищенной хитиназы i . Научная новизна. Проведено комплексное исследование, включающее изучение особенностей продукции хитиназы штаммом i . Впервые для бацилл проведено подробное исследование влияния препаратов очищенной хитиназы на развитие некоторых фитопатогенных грибов. Показана неспособность высокоочищенного фермента ингибировать рост и развитие грибов i vi при сохранении миколигической активности. Установлена множественность форм хитиназ, образуемых i . Впервые обнаружена способность i . Установлена конститутивная способность исследуемого штамма к образованию внеклеточной р1,3глюканазы ламинариназы. Практическая ценность работы. Изучены условия максимальной продукции хитиназы штаммом i . Бациспецнн, предназначенного для защиты злаковых культур от болезней, вызываемых фитопатогенными фибами Пат. Россия. Апробация работы. Результаты работы докладывались на международной научной конференции Микробное разнообразие состояние, стратегия сохранения, экологические проблемы Пермь, , на международной конференции Молекулярная генетика и биотехнология Минск, . Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ, в том числе 2 материала статей и 1 статья. Структу ра и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы 1 глава, описание объектов и методов исследования 1 глава, экспериментальную часть и обсуждение результатов 3 главы, заключение, выводы и список цитируемой литературы, содержащий 5 ссылок, из них на русском языке. Работа изложена на 7 страницах машинописного текста и содержит рисунка и таблиц. СсКАс г .