Фенотипический и генетический анализ изогенных вариантов холерного вибриона с альтернативным уровнем экспрессии факторов патогенности и персистенции

• Автор: Исаев, Николай Джучиевич
• Шифр специальности: 03.00.07, 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 149 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ПРИНЯТЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. ОСНОВНЫЕ ФАКТОРЫ ПАТОГЕННОСТИ И ПЕРСИСТЕНЦИИ У ВОЗБУДИТЕЛЯ ХОЛЕРЫ

1.1.1. Основные факторы патогенности К .

1Л.2. Факторы персистенцин

1.2. УЧАСТИЕ РАЗЛИЧНЫХ ГЛОБАЛЬНЫХ РЕГУЛЯТОРНЫХ СИСТЕМ В ГЕНЕТИЧЕСКОМ КОНТРОЛЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ПАТОГЕННОСТИ И ПЕРСИСТЕНЦИИ У ВОЗБУДИТЕЛЯ ХОЛЕРЫ.

1.2.1 Регуляторная система i.

1.2.2. Негативная регуляция продукции факторов патогенности.

1.2.3. Регуляторный механизм координированного переключении генов, кодирующих факторы вирулентности н персистенцин.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Бактериальные штаммы.
2.2. Питательные среды и реактивы.
2.3. Методы.
2.3.1. Культивирование штаммов
2.3.2. Определение продукции холерного токсина
2.3.3. Определение продукции ферментов растворимой гемагглютининпротеазы и фосфолипазы
2.3.4. Определение подвижности
2.3.5. Электрофоретический анализ.
2.3.6. Выявление присутствии полисахаридов
2.3.7. Иммуноблоттннг
2.3.8. Двумерный электрофорез н определение массы полученных пептидов
2.3.9. Выделение экзополисахарида
2.3 Количественное определение углеводов.
2.3 Тонкослойная хроматография и высоэффективиая жидкостная хроматография.
2.3 Выделение хромосомной ДНК
2.3 Электронномикроскопический анализ холерных вибрионов
2.3 Блотгибридизация
2.3 ПЦРтестироваиие.
2.3 Определение вирулентности и холерогенности изучаемых штаммов
2.3 Секвеиирование
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА 3. ВЫЯВЛЕНИЕ В ПРИРОДНЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ К СНОЬЕПАЕ КЛОНОВ С РАЗЛИЧНОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ НЕСКОЛЬКИХ ФАКТОРОВ ВИРУЛЕНТНОСТИ
3.1. Исследование популяционного состава природных штаммов V. скокгае классического биовара.
3.2. Культуральные и биохимические свойства морфологически разных вариантов модельного штамма К сИокгае Дакка
3.3. Изучение генетических свойств двух фенотипически разных вариантов штамма V скокгае Дакка .
ГЛАВА 4. ВЫЯВЛЕНИЕ У V. СНОЬЕКАЕ КЛАССИЧЕСКОГО БИОВАРА ЭКЗОПОЛИСАХАРИДНОГО СЛОЯ И ЕГО БИОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИ
4.1. Сравнительное электронномикроскопическое изучение поверхности Т Тох Нар и О Тох Нар клонов V. Дакка .
4.2. Определение углеводного состава экзополисахаридного слоя и изучение его функциональной роли у модельною штамма Дакка
ГЛАВА 5. ПРОТЕОМНЫЙ АНАЛИЗ ДВУХ ИЗОГЕННЫХ ВАРИАНТОВ V. СНОЬЕЯАЕ КЛАССИЧЕСКОГО БИОВАРА С АЛЬТЕРНАТИВНОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ ГЕНОВ ВИРУЛЕНТНОСТИ И ПЕРСИСТЕНТНОСТИ И
ВЫЯВЛЕНИЕ СИГНАЛОВ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИХ КООРДИНИРОВАННОЕ ИЗМЕНЕНИЕ ИХ ЭКСПРЕССИИ.
5.1. Протеомный анализ изогенных Тох Нар и Тох Нар вариантов штамма V Дакка .
5.2. Выявление сигналов внешней среды, вызывающих координированное переключение синтеза факторов патогенности и персистентности.
5.3. Популяционная изменчивость изогенных вариантов штамма Дакка в условиях i vi и i viv.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ИСТОЧНИКОВ


Иапбе, расположенный на поверхности бактериальных клеток и обеспечивающий высокий уровень их устойчивости к различным повреждающим воздействиям окружающей среды УПсНг Р. Н. еа. АН А. При этом клоны, продуцирующие экзополисахарид, менее подвижны по сравнению с гладкими или 8 вариантами ii Р. Н. е а. И совсем недавно УПсНг Р. Н. с а. ВсуЬап Б. Для решения поставленных вопросов в качестве модельного объекта были взяты холерные вибрионы классического биовара, так как до настоящего времени не были предприняты попытки выявления причин фенотипической гетерогенности популяции этого возбудителя с использованием современных методов исследования. Индии и Бангладеш i i, Л. Несмотря на утрату ими в настоящее время пандемического потенциала, штаммы этого возбудителя являются одним из природных резервуаров генов вирулентности. Об этом свидетельствует выделение в гг. Бангладеш клинических штаммов холерного вибриона биовара эльтор, которые в результате горизонтального переноса генетической информации приобрели ряд генов возбудителя азиатской холеры ген из острова патогенности VI1 и ген из профага СТХ i . Кроме того, высокий уровень продукции холерного токсина, токсиикорегулируемых пилей адгезии и других факторов вирулентности у холерных классических вибрионов по сравнению с вибрионами эльтор делают их наиболее удобным модельным объектом для исследования многих вопросов регуляции генной активности i vi. ЦЕЛЬ РАБОТЫ выявление и изучение морфологических, биохимических и генетических особенностей изогенных клонов К классического биовара с альтернативным и одновременным изменением уровня продукции факторов патогенности и персистснции. Изучить популяционный состав природных штаммов V. Провести сравнительный анализ морфологических, биохимических и генетических свойств двух фенотипически разных клонов модельного штамма V. Дакка с различным уровнем продукции экзополисахарида , холерного токсина Тох, растворимой гемагглютининпротеазы Нар, а также подвижности . Выделить, очистить и изучить моносахаридиый состав экзополисахаридного слоя, обнаруженного на поверхности клеток Тох Нар модельного штамма V. Дакка . Получить белковые портреты двух фенотипически разных изогенных вариантов штамма V. Дакка Тох Нар и Тох Нар , провести их сравнительный анализ и выяснить роль отдельных белков в адаптации клеток к меняющимся условиям внешней среды. Выявить сигналы внешней среды, вызывающие смену фенотипа клеток в популяции V классического биовара. При экспериментальной инфекции определить вирулентность двух фенотипически разных Тох Нар и Тох Нар субпопуляций V. При изучении популяционного состава штаммов холерного вибриона классического биовара впервые выявлены штаммы с координированным альтернативным уровнем экспрессии четырех факторов патогенности и перснстенции. Впервые на поверхности клеток классических холерных вибрионов обнаружен экзоиолисахаридный слой в клетках, определяющий мутность колоний. Установлена его функциональная роль, которая состоит в защите клеток от воздействия стрессовых факторов внешней среды. Впервые установлено, что при повышении среды до 9,0 происходит альтернативное изменение уровня экспрессии генов, определяющих продукцию экзополисахарида, холерного токсина, растворимой гемагглютининпротеазы, а также подвижности в популяции клеток Тох Нар . Впервые проведен сравнительный протеомный анализ двух изогенных фенотипически разных вариантов Тох Нар и Тох Нар модельного штамма V. Дакка и показана дифференциальная продукция около белков. Установлено, что координированное изменение клеточного метаболизма, адекватное условиям внешней среды, определяет степень вирулентности бактериальной популяции. По результатам работы составлены методические рекомендации Получение штаммов холерного вибриона классического биовара с координированным изменением экспрессии факторов патогенности и персистенции, которые одобрены Ученым Советом РосНИПЧИ Микроб протокол 7 от июня г. Предложенный мегодический прием позволяет использовать один и тот же штамм холерного вибриона классического биовара для получения различных биологически акгивных веществ, изменяя условия его культивирования.