Регуляция экспрессии генов гуанилспецифичных рибонуклеаз Bacillus intermedius и Bacillus pumilus

• Автор: Вершинина, Ольга Анатольевна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 150 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

. Сравнительная характеристика внеклеточных гуинилспеиифичных рибонуклеаз .ii, .i, .ii

1.1. Физикохимические свойства и структура белков

1.2. Биосинтез рибонуклеаз. Клонирование генов.

2. Механизмы фосфатной регуляции у бактерий.

2.1. РНО регулон у ii i

2.2. РНО регулон у i ii.

Заключение.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

1. Материалы и методы исследований.
2. Результаты исследований.
2.1. Анализ структуры промоторов генов рибонуклеаз .ii и .i
2.2. Экспрессия генов рибонуклеаз В. ii и .i в клетках
.i
2.3. Получение рекомбинагтньх штаммов В.ii, несущих плазмиды с генами бациллярных рибонуклеаз
2.3.1. Обоснование использования В.ii в качестве реципиента плазмид, несущих гены гуанилепецифичиых рибонуклеаз.
2.3.2. Получение плазмид, несущих полные гены рибонуклеаз .ii и .i для экспрессии в клетках В.ii.
2.3.3. Определение стабильности плазмид и иммунохимическое тестирование рибонуклеаз, синтезируемых рекомбинантными штаммами .ii.
2.4. Экспрессия генов рибонуклеаз В. ii и .i в рекомбинантных штаммах .ii на средах различного состава
2.4.1 .Экспресссия генов рибонуклеаз на среде с низким содержанием
фосфата
2.4.2.Экспрессня генов рибонуклеаз на синтетических средах различного состава
2.5. Выяснение роли двухкомпонентной системы трансдукции сигнала в регуляции экспрессии генов рибонуклеаз .ii
и .i в клетках .ii.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ.
ЛИТЕРАТУРА


Причиной этого было токсическое действие, которое оказывал фермент на клсткухозяина. Поэтому ген барназы был клонирован сначала в неактивной форме с использованием вставки Тп7 в кодон аминокислоты, необходимой для проявления каталитической активности i 2 , . Полный ген неактивной барназы экспрессировался в клетках . .i. Клонировать активную барназу удалось Р. Хартли с использованием конструкции, в которой ген барназы был сцеплен с геном ее внутриклеточного ингибитора барстара , . В дальнейшем эта генная конструкция была использована для клонирования генов РНКаз других видов бацилл в составе плазмид, несущих ген барстара. Таким образом были клонированы гены рибонуклеаз В. . .iii Кожаринова и др. .i Федорова и др. .i . К настоящему времени изучен биосинтез гуанилепеиифнчных РНКаз, продуцируемых . .ii и . Установлено, что синтез бнназы и РНКазы Вр подавляется экзогенным фосфатом, тогда как синтез барназы не подвержен фосфатной регуляции . В.ii в присутствии Фн не является результатом ингибирования активности фермента, а происходит вследствие репрессии его синтеза. Экспериментами с хлорамфеннколом показано, что увеличение рибонуклеазной активности у В. Знаменская и др. Бациллы синтезируют РНКазы, как и большинство внеклеточных ферментов, в стадию замедления роста. Установлено, что для интенсивного биосинтеза РНК аз необходимы легкомегаболизирусмые источники углерода и энергии, утилизация которых сопровождается снижением культуральной жидкости, например, глюкоза, фруктоза, сахароза, маннит Знаменская и др. В.ii и . РНКазу на средах с минеральными источниками азота. Оптимальным источником азота для синтеза РНКаз является обедненный по фосфору пептон Лсщинская и др. Для активного биосинтеза РНКазы Вр требуется большее содержание пептона в 2 раза и меньшее глюкозы в 3 раза, чем для биосинтеза биназы Знаменская и др. Важное значение для биосинтеза имеет солевой состав среды. Установлены некоторые различия в динамике накопления этих ферментов и степени подавления их биосинтеза фосфатом среды Знаменская и др. Максимальная активность биназы в культуральной жидкости . РНКазы Вр позднее, только к часу. В.ii подавляется на , а РНКазы . .ii и . Установлена корреляция между регуляцией синтеза РНКаз фосфатом среды и стимуляцией их синтеза специфическим ингибитором транскрипции актиномицином Д. .ii и . Д. Биосинтез барназы не подавляется фосфатом и не активируется в присутствии акгиномицина Д Габдрахманова и др. Наряду с изучением механизмов биосинтеза РНКаз исходными штаммами . .i и . .i Знаменская и др. Габдрахманова и др. Для этого были использованы плазмиды, в которых структурные тоны РНКаз находились под собственными и синтетическими регуляторными областями промотор и сигнальная последовательность. Было показано, что подавление экспрессии генов биназы и РНКазы Вр экзогенным фосфатом происходит только иод собственными промоторами и сигнальными последовательностями, но не под регуляторной областью барназы и не под синтетической регуляторной областью промотор и сигнальная последовательность гена . Эти результаты свидетельствуют о том, что регуляция экспрессии генов биназы и РНКазы Вр в рекомбинантах . Анализ структуры регуляторных областей генов биназы и РНКазы Вр показывает их высокую гомологию. Так. В сигнальной последовательности обнаруживается 6 отличающихся нуклеотидов, 5 из которых приводят к различиям в аминокислотном составе. В то же время регуляторная область барназы абсолютно отлична от регуляторных областей биназы и РНКазы Вр. При существенном отличии промоторов, структурные гены всех трех РНКаз обнаруживают высокую гомологию. При этом, гены биназы и РНКазы Вр имеют отличающихся нуклеотидов, не приводящих к различиям по аминокислотному составу гомология по нуклеотидной последовательности . Гомология биназы и РНКазы Вр со структурным геном барназы составляет .