Разработка системы продукции лактоферрина человека in ovo и in vivo с использованием рекомбинантных аденовирусов

• Автор: Тутыхина, Ирина Леонидовна
• Шифр специальности: 03.00.07, 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 144 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Вирусные системы доставки генов в клетки эукариот

1.2. Свойства аденовирусных векторов

1.3. Структурнофункциональная организация аденовируса птиц

1.4. Векторы на основе аденовируса птиц

1.5. Структура, свойства и способы получения лактоферрипа человека

1.5.1 .Структурная характеристика лактоферрина

1.5.2. Связывание лактоферрина с лигандами и рецепторами

1.5.3. Функции лактоферрина.

1.5.3.1. Активация и ингибирование иммунной системы лактоферрином

1.5.3.2. Влияние лактоферрина на воспалительный процесс.
1.5.3.3. Бактерицидные свойства лактоферрина
1.5.4. Способы получение лактоферрина человека
1.5.5. Применение лактоферрипа
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Материалы.
2.1.1. Вирусы и бактериальные штаммы
2.1.2. Клеточные линии
2.1.3. Плазмидные векторы.
2.1.4. Ферменты и другие реактивы.
2.1.5. Лабораторные животные
2.1.6. Лабораторное оборудование
2.2. Методы
2.2.1. Подготовка компетентных клеток . i штамма 5
2.2.2. Подготовка компетентных клеток . i штамма .
2.2.3. Трансформация компетентных клеток . i штамма II5
2.2.4. Трансформация компетентных клеток . i штамма .
2.2.5. Гомологичная рекомбинация в клетках . i
2.2.6. Выделение аналитических количеств плазмидной ДНК
2.2.7. Выделение и очистка плазмидной ДНК
2.2.8. Рестрикционный анализ ДНК специфическими эндодезоксирибонуклеазами
2.2.9. Обработка ДНК Фрагментом Кленова
2.2 Фракционирование фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле.
2.2 Препаративное разделение фрагментов ДНК и элюция ДНК из
2.2 Лигирование фрагментов ДНК.
2.2 Идентификация рекомбинантных клонов
2.2 Полимеразная цепная реакция
2.2 ПЦР в режиме реального времени.
2.2 Выделение тотальной РНК из культуры клеток.
2.2 Реакция обратной транскрипции
2.2 Трансфекция культур клеток методом липофекции
2.2 Трансфекция культур клеток методом кальциевофосфатной преципитации.
2.2 Получение рекомбинантных аденовирусов человека 5го серотипа.
2.2 Котрансфекция клеток линии для получения рекомбинантных аденовирусов
2.2 Накопление вирусов.
2.2 Очистка и концентрирование аденовирусов .
2.2 Очистка и концентрирование аденовирусов человека 5го серотипа
2.2 Выделение ДНК из клеток, инфицированных аденовирусами
2.2 Титрование вирусов.
2.2 Выделение вирионной ДНК
2.2 Электрофорез белков в ПААГДСН .
2.2 Иммунофермснтлый анализ.
2.2 Иммуноблоттинг I.
2.2. . Получение аффинночистых антител к лактоферрину человека
2.2. . Очистка рекомбинантного лактоферрина человека из
культуральной и аллантоисной жидкости
2.2. . Обработка лактоферрина человека депшкозидазой
2.2. . Анализ антиоксидантной активности лактоферрина человека
2.2 Определение ферменативной активности секретируемой
плацентарной щелочной фосфатазы в образцах культуральной жидкости сыворотки крови мышей.
2.2 Проточная цитофлуорометрия
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Конструирование рекомбинантных аденовирусных векторов на основе генома аденовируса птиц и генома аденовируса человека 5го серогипа.
3.1.1. Конструирование вектора на основе генома аденовируса птиц , обеспечивающего повышенный уровень экспрессии гена секретируемой щелочной фосфатазы в лермиссивной и
непермиссивной системе i vi и i viv.
3.1.1.1. Конструирование гшазмидных векторов, содержащих в экспрессирующей кассете последовательности и лидера гена гексона вируса .
3.1.1.2. Изучение влияния и нетранслируемой области гена гексона вируса птиц на экспрессию гена в составе челночных плазмидных векторов в клетках млекопитающих и птиц
3.1.1.3. Получение рекомбинантного аденовируса методом гомологичной рекомбинации в культуре клеток
3.1.1.4. Экспрессия при трансдукции клеточных культур
рекомбинантным аденовирусом .
3.1.1.5. Экспрессия секретируемой щелочной фосфатазы в клетках куриных эмбрионов, инфицированных рекомбинантным аденовирусом .
3.1.1.6. Экспрессия секретируемой щелочной фосфатазы рекомбинантным аденовирусом i viv.
3.1.2. Конструирование рекомбинантных аденовирусных векторов,
экспрессирующих ген лактоферрина человека
3.1.2.1. Конструирование рекомбинантного аденовируса птиц , несущего экспрессирующую кассету с геном Лф человека
3.1.2.2. Конструирование рекомбинантного аденовируса человека 5го серотипа, экспрессирующего ген лактоферрина человека
3.1.2.3. Определение уровня экспрессии гена Лф человека в составе рекомбинантных аденовирусов и Ад5ЕГ
3.2. Анализ экспрессии Лф человека рекомбинантными
аденовирусами и Адб i v и i viv.
3.2.1. Анализ экспрессии Лф человека рекомбинантными аденовирусами и Адб i viv.
3.2.2. Анализ экспрессии Лф человека рекомбинантными аденовирусами и Адб i v
3.2.3. Анализ аутентичности рекомбинантного Лф, экспрессируемого
рекомбинантными аденовирусными векторами, природному.
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


В работе Л. В. Череновой показано, что при размножении в курином эмбрионе рекомбинантного вируса , в аллантоисной жидкости происходило накопление продукта экспрессии гена интерлейкина2, включенного в состав его генома. Данный факт служит предпосылкой для разработки на основе эукариотической системы продукции рекомбинантных белков в курином эмбрионе. Примером белков человека, нуждающихся в разработке для его продукции новых систем экспрессии, является лактоферрин. Он обладает перспективными в биофармацевтическом плане свойствами антибактериальной, иммуномодулирующей, противовоспалительной и антиоксидантной активностью. Многогранность физиологических функций Лф обусловливает перспективность создания на его основе лекарственных средств широкого спектра действия. В настоящее время в клинике используется лактоферрин, выделяемый из донорского женского молока. В связи с этим, широкое его применение ограничивается недостаточностью сырья. Поэтому получение рекомбинантного аналога лактоферрина человека аутентичного природному белку в препаративных количествах является актуальной задачей. Например, при внутривенной инфузии лактоферрнна человека период его полураспада в организме составляет всего несколько часов. Пролонгация действия препарата в организме достигается путем его регулярного введения в течение дней через каждые часа, что зачастую является причиной токсических состояний реципиентов. Новым подходом к решению данной проблемы может стать доставка и длительная экспрессия гена целевого белка непосредственно в организме, осуществляемая аденовирусными векторами. Наиболее целесообразно использование вектора на основе аденовируса 5го серотипа. Таким образом, получение рекомбинантных аденовирусов человека и птиц, экспрессирующих ген лактоферрнна человека, для продукции биологическиактивного белка i viv и в курином эмбрионе, является актуальным направлением исследований. Цели и задачи исследования. Целыо настоящей работы являлось получение рекомбинантных аденовирусов млкоиитающих и птиц, экспрессирующих геи лактоферрина человека, для продукции биологически активного рекомбинантного лактоферрина в эукариотических клетках i v и i viv. Создание вектора на основе генома аденовируса птиц , обеспечивающего повышенный уровень экспрессии целевого гена в пермиссивной и непермиссивной системе. Конструирование рекомбинантных аденовирусов и Ад5Ы, экспрессирующих ген лактоферрина человека. Анализ экспрессии рекомбинантного лактоферрина человека в культуре эукариотических клеток, инфицированных полученными рекомбинантными аденовирусами. Изучение продукции рекомбинантного лактоферрина человека в клетках млекопитающих i viv на модели лабораторных животных. Получение лактоферрина человека в куриных эмбрионах, инфицированных рекомбинантным аденовирусом . Изучение физикохимических, антигенных и биологических свойств антиоксидантная активность рекомбинантного лактоферрина человека. Научная новизна и практическая значимость. В результате проведенной работы нами впервые был получен рекомбинантный аденовирус птиц , обеспечивающий повышенный уровень экспрессии целевого гена в пермиссивной и непермиссивной системе i vi, i v и i viv. Для этой цели впервые были использованы регуляторные 5нетрапслируемыс элементы поздней области транскрипции генома вируса двучастный лидер и лидер гена гексона. В результате проведенных экспериментов по трансфекции плазмидными конструкциями 5 и р5I, а также трансдукции вирусом пермиссивных и непермиссивиых клеточных культур была показана функциональная независимость дву частного лидера от цистранс взаимодействия с вирусом . Впервые было установлено на примере 5нстранслируемой области гена гексона, что подобные структурные элементы генов поздней области транскрипции генома аденовируса имеют большое значение в процессе экспрессии. Впервые был сконструирован рекомбинантный аденовирус птиц , несущий экспрессирующую кассету с геном лактоферрина человека под контролем Vпромотора, дву частного лидера и 5нетранслируемой области гена гексона вируса .