Разработка основ молекулярно-генетического исследования возбудителя мелиоидоза и близкородственных буркхольдерий

• Автор: Замараев, Валерий Семенович
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 211 с. : 68 ил.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ВВЕДЕНИЕ

ТАКСОНОМИЯ, БИОЛОГИЯ И ГЕНЕТИКА БУРКХОЛЬДЕРИЙ

1.Г. Геиосистсматика буркхольдсрнй

1.2. Биологические свойства и генетика патогенных буркхольдерий

Г.З Гибридизационный анализ буркхольдерий.

ПЛАЗМИДЫ ВОЗБУДИТЕЛЯ МЕЛИОИДОЗА

2.1 Роль плазмид в биологии микроорганизмов.

2.2. Выделение нлазмидной ДНК из штаммов буркхольдерий

2.2.1. Ускоренный метод обнаружения плазмид В.i.

2.2.2. Препаративное выделение плазмидных ДНК В.i

2.3 Плазмидный анализ штаммов буркхольдерий.
2.3.1. Изучение плазмидного спектра штаммов В.i.
2.3.2. Изучение стабильности наследования плазмид В.i
2.3.3. Рестрикционный анализ внехромосомных ДНК буркхольдерий
2.4. Изучение гомологии плазмидных ДНК буркхольдерий.
2.4.1. Изучение взаимной гомологии плазмид возбудителя мелиоидоза
. 2.4.2. Изучение гомологии плазмид возбудителя мелиоидоза с ДНК
гетерологичиых видов микроорганизмов.
2.4.3. Изучение гомологии ДНК криптической плазмиды рРМ1и фагов возбудителя мелиоидоза
СТРУКТУРНОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ПЛАЗМИД ВОЗБУДИТЕЛЯ МЕЛИОИДОЗА
З.Г. Физическое картирование плазмид В.i .
3.1.1. Рестрикционный анализ и построение физической карты рРМ1 .
1 3.1.2. Рестрикционный анализ и построение физической карты рСМ2
3.2 Функциональнаяорганизация плазмид В,i .
3.2.1. Локализация области начала репликации плазмиды .
3.2.2. Клонирование фрагментов плазмиды рМ1 и изучение продуктов
экспрессии.
3.2.3. Клонирование фрагментов плазмиды рСМ2 и изучение продуктов
экспрессии.
ПЛАЗМИДНЫЕ ВЕКТОРЫ И КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ДЕТЕРМИНАНТ БУРКХОЛЬДЕРИЙ
4.1. Получение векторов для широкого круга бактериальных хозяев.
4.2. Передача крит ических плазмид .i в В i
4.2.1. Мобилизация плазмидных репликонов возбудителя мелиоидоза в штаммы возбудителя сапа.
4.2.2. Анализ плазмидных профилей и фенотипических свойств грансконьюгантов В.i.
4.3. Клонирование генетических детерминант .i
4.3.1. Конструирование и анализ геномной библиотеки на основе плазмидного вектора 2
4.3.2. Конструирование и анализ геномной библиотеки на основе плазмидного вектора .
4.3.3. Конструирование и анализ геномной библиотеки на основе плазмидного вектора 5
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ ПАТОГЕННЫХ
БУРКХОЛЬДЕРИЙ
5.1. Молекулярногенетические методы дифференциации и идентификации микроорганизмов.
5.2. Генетическая трансформация как метод идентификации.
5.3. Рестрикционный анализ ПДРФ микроорганизмов
5.4. Получение группоснсцифического ДНКзонда для идентификации буркхольдернй .
5.4.1. Оценка гибридизационной активности рестрикционных фрагментов криптической плазмиды рРМ1 возбудителя мелиоидоза.
5.4.2. Конструирование ДНКзонда на основе фрагмента криптической плазмиды рРМ1
5.4.3. Выявление гомологии ДНК фагаМ и генома возбудителя мелиоидоза.
5.5. Идентификация патогенных буркхольдернй методом полимеразной цепной реакции
5.5.1. Отработка условий постановки ПЦР
5.5.2. Конструирование и анализ эффективности праймеров на основе гена рРНК
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


РМ1 возбудителя мелиоидоза способен функционировать Вч клетках кишечной палочки. Клонированная в . ДНК плазмиды рРМ1, локализованная в пределах и О координат е физической карты, детерминирует в штаммах кишечной палочки множественную резистентность к антибиотикам, формирование капсулоподобной структуры и синтез дополнительных белков наружной мембраны, специфически взаимодействующих с мелиоидозной сывороткой. ПТ фрагмент, размером 2,1 т. СМ2 возбудителя мелиоидоза детерминирует в рекомбинантном штамме . Да, специфически взаимодействующего с иммуноглобулинами В. Данный фрагмент обладает гомологией с представленными в нуклеотидными последовательностями плазмидных репликонов 2 и рРТ, ответственных за синтез и белков. Криптичсские плазмидные репликоны рСМ2 и рСМЗ В. В.i коньюгативными плазмидами Р1 группы несовместимости, стабильно наследуются в трансконъюгантах, как правило, вместе с мобилизующими плазмидами, образуя в ряде случаев делеционные варианты и оказывая опосредованное влияние на вирулентность рекомбинантных штаммов возбудителя сапа. Клонированные последовательности хромосомной ДНК В. I и поливалентной мелиоидозной сывороткой. Мультиплексная ПЦР обнаруживает в рекомбинантных штаммах дополнительный ампликон размером 5 п. В.i обладает высокой степенью ДНКгомологии, а также сходством, рекомбинационных систем с . Феномен генетической трансформации, основанный на природной трансформабельности возбудителя мелиоидоза, является эффективным методом идентификации В. Фрагмент плазмиды возбудителя мелиоидоза, находящийся в пределах сайтов I 5. I 9. ДНКДНК гибридизации. Рекомбинантный фаг МРМ, содержащий Iфрагмент гомологичного участка критической плазмиды, является продуцентом группоспецифического ДНКзонда для идентификации буркхольдерий. Диссертация выполнена на основе государственных плановых тем, в 9 из которых соискатель являлся научным руководителем. Основные результаты диссертации изложены в опубликованных работах, в том числе в двух патентах, трех авторских свидетельствах, двух коллективных монографиях и практическом пособии по подготовке врачейбактериологов и эпидемиологов по вопросам противодействия биотерроризму. Материалы диссертации были представлены на. Всесоюзной, конференции Теоретическая и прикладная инфекционная иммунология Москва, , Российской научной конференции Генетика и биохимия вирулентности особо опасных инфекций Волгоград, , Российской научной конференции Современные аспекты природной очаговости, эпидемиологии и профилактики особо опасных инфекционных болезней Ставрополь, , 7ом международном конгрессе Бактериология и прикладная микробиология Прага, , международном симпозиуме Идеи Пастера в борьбе с инфекциями СанктПетербург, , международной научной конференции, посвященной 0летию со дня рождения. И.И. Биотехнология. Ветеринария. Киров, , научной конференции, посвященной летию ГНЦ прикладной микробиологии Проблемы медицинской и экологической биотехнологии Оболенск, , 1й научнопрактической конференции Генная диагностика особо опасных инфекций Саратов, , VIII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов Москва, , научнопрактическом симпозиуме в рамках международной конференции Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины Москва, , IV всероссийской научнопрактической конференции Генодиагностика инфекционных заболеваний Москва, , IV межгосударственной научнопрактической конференции государств стран СНГ Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней Саратов, . XI Российском национальном конгрессе Человек и лекарство Москва, , на итоговых ежегодных научных конференциях Волгоградского научноисследовательского противочумного института. Объем и структура работы. Диссертация изложена в форме монографии на 9 листах машинописного текста, состоит из введения и 5 глав, включающих описание литературных данных и результаты собственных исследований, заключения и выводов. Работа содержит литературные ссылки и иллюстрации в виде таблиц и рисунков. Указатель литературы включает 2 источников.