Разработка метода специфической детекции и видовой дифференциации возбудителей хламидиозов на основе структурного полиморфизма гена отр2

• Автор: Зимин, Андрей Леонидович
• Шифр специальности: 03.00.07, 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 84 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Принятые сокращения

Введение

Глава I. Обзор литературы

1.1. Общая характеристика хламидий. Строение клеточной стенки и

, жизненный цикл хламидий

V 1.2. Таксономия хламидий

1.3. Геном хламидий

1.4. Физиология хламидий. Взаимодействие с клеткойхозяином

1.5. Белки наружной мембраны клеточной стенки хламидий

1.6. Заболевания, вызываемые хламидиями

1.7. Методы обнаружения и дифференциации хламидий
Глава II. Материалы и методы исследования
2.1. Материалы
2.1.1. Объект исследования
2.1.2. Плазмидные векторы
2.1.3. Ферменты и другие реактивы
2.2. Методы
2.2.1. Выделение и очистка плазмидной ДНК
2.2.2. Полимеразная цепная реакция
2.2.3. Синтез дезоксиолигонуклеотидов
2.2.4. Проверка качества синтезированных праймеров
2.2.5. Расщепление ДНК специфическими эндонуклеазами рестрикции.
2.2.6. Фракционирование фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле.
2.2.7. Фракционирование фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле, содержащем ДНКсвязывающий лиганд
2.2.8. Клонирование фрагментов ДНК
2.2.9. Трансформация клеток Е.соИ и отбор гибридных клонов
2.2 Сиквенирование клонированных фрагментов ДНК
л 2.3. Использовавшееся программное обеспечение
Глава Ш. Результаты исследования и обсуждение
3.1 Выбор генетической мишени.
3.2 Общий анализ нуклеотидной последовательности гена отр2
3.3 Сиквенирование гена отр2 у С.i и .i.
3.4 Филогенетический анализ видов сем. i на основе нуклеотидных последовательностей гена отр2.
3.5 Разработка систем специфической детекции различных представителей сем. i.
3.6 Разработка системы видовой дифференциации хламидий.
3.6.1. Создание ПЦРсистем, обладающих родовой и видовой специфичностью для различных представителей семейства i.
3.6.2. Обнаружение структурного полиморфизма фрагментов гена отр2 методом задержки электрофоретической подвижности ампликонов в геле с ДНКсвязывающим лигандом.
3.6.3. Обнаружение структурного полиморфизма фрагментов гена отр2 методом анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ДНК.
3.6.4. Сочетанное применение методов анализа ПДРФ и электрофореза в геле с ДНКсвязывающим лигандом для идентификации всех представителей семейства i.
3.7. Апробация разработанной системы идентификации и видовой дифференциации представителей семейства i на коллекции штаммов хламидий.
3.8. Заключение
Выводы
Приложения к работе
Список литературы


Глава I. Общая характеристика хламидий. V 1. Физиология хламидий. Глава II. Выделение и очистка плазмидной ДНК
2. Расщепление ДНК специфическими эндонуклеазами рестрикции. Фракционирование фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле. Трансформация клеток Е. Глава Ш. Выбор генетической мишени. Сиквенирование гена отр2 у С. Филогенетический анализ видов сем. Разработка систем специфической детекции различных представителей сем. Разработка системы видовой дифференциации хламидий. Создание ПЦРсистем, обладающих родовой и видовой специфичностью для различных представителей семейства i. Обнаружение структурного полиморфизма фрагментов гена отр2 методом задержки электрофоретической подвижности ампликонов в геле с ДНКсвязывающим лигандом. Обнаружение структурного полиморфизма фрагментов гена отр2 методом анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ДНК. Сочетанное применение методов анализа ПДРФ и электрофореза в геле с ДНКсвязывающим лигандом для идентификации всех представителей семейства i. Апробация разработанной системы идентификации и видовой дифференциации представителей семейства i на коллекции штаммов хламидий. Создание простого и удобного метода специфической детекции и видовой дифференциации хламидий одна из наиболее актуальных задач современной хлам иди ологии. Впечатляющее количество научных работ, посвященных этой тематике лучший критерий необходимости подобной системы для нужд фундаментальной и клинической микробиологии. Высокая значимость хламидий как патогена определяет высокую особенно в последние годы скорость накопления новых знаний о биологическом разнообразии и генетике этих организмов. Результатом этого является существенное увеличение за последнее десятилетие числа идентифицированных видов в семействе i. Так, если в году после добавления нового вида i ресогит ныне i ресогит общее число известных видов хламидий достигло 4х, то предложенная в году таксономия определяет уже 9 видов этих организмов. Таким образом, решение вопросов видовой дифференциации хламидий, ранее сталкивавшееся только с проблемами, связанными со сложностью изучения объекта и недостаточной степенью изученности геномов хламидий, в настоящее время усложняется еще и необходимостью пересмотра методических критериев и приемов, разработанных на более ранних этапах исследований, в соответствии с требованиями современной систематики. Это коснулось ряда систем, которые были предложены для видовой дифференциации хламидий в серединеконце х годов, и которые во многом потеряли свою специфичность и способность к тииированию современных видов хламидий после изменения классификации семейства i. В частности, в работе группы японских ученых под руководством др. Нi была предложена система дифференциации всех видов хламидий, основанная на ПЦРамплификации фрагмента гена отр и последующим анализе ПДРФ ампликона, обработанного рестриктазой . Согласно положениям существовавшей тогда классификации эта система позволяла дифференцировать большинство штаммов представителей четырех видов хламидий, однако изменение таксономии и появление новых видов в составе семейства i сделало невозможным ее применение для генотипирования современных видов хламидий. Публикация в году в Ii i i работы ii i, i i .