Прототипы сибиреязвенных вакцин на основе генно-инженерных бациллярных штаммов и синтезируемых ими антигенов

• Автор: Микшис, Наталья Ивановна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 253 с. : 44 ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .

1.1. Основные факторы патогенности и иммуногенности сибиреязвенного микроба и их генетическая детерминация

1.2. Сибиреязвенные вакцины прошлое, настоящее и будущее

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Штаммы микроорганизмов, бактериофаги и плазмиды, использованные в работе

2.2. Питательные среды, реактивы и лабораторные животные

2.3. Методы исследования

2.3.1. Определение видовых признаков В. атикгасн
2.3.2. Определение способности к синтезу капулы сибиреязвенных культур
2.3.3. Определение протеолитичсской, гемолитической актив
ности, способности к пигментсинтезу и сорбции конго красного
2.3.4. Микроскопическое исследование клеток штаммов В.
апгаЫз
2.3.5. Определение способности сибиреязвенных культур к
споруляции
2.3.6. Определение стабильности свойства аспорогенности
2.3.7. Приготовление споровой взвеси
2.3.8. Определение ЛД бациллярных штаммов для морских
свинок, беспородных белых мышей и мышей линии ВАЬВс
2.3.9. Определение иммуногенности штаммов и препаратов
2.3 Методы генетического обмена трансдукция, конъюгация штаммов В. i, трансформация бациллярных штаммов
2.3 Элиминация плазмид, транспозонный мутагенез
2.3 Выделение плазмидных ДНК штаммов В. i и
В. ii
2.3 Рестрикция ДНК плазмид
2.3 Конструирование гибридной плазмиды с клонированным геном сибиреязвенного микроба
2.3 Определение стабильности гибридных плазмид i vi и
i viv
2.3 Метод полимеразной цепной реакции
2.3 Исследование белкового состава культуральных фильтратов
2.3 Выделение и очистка
2.3 Выделение и очистка ЕА1
2.3 Выделение и очистка ПА из рекомбинантного штамма В.
i
2.3 Определение концентрации белка в препаратах
2.3 Получение иммунных сывороток и специфических антител к ПА и белкам слоя
2.3 Биохимические и электронномикроскопические методы
идентификации белков слоя
2.3 Иммунохимические реакции иммуноблот, рекция радиальной преципитации, дотанализ, твердофазный ИФА
2.3 Статистические методы
ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ОСНОВЫ ДЛЯ СОЗДАНИЯ ЭФФЕКТИВНЫХ СИБИРЕЯЗВЕННЫХ ВАКЦИННЫХ ПРЕПАРАТОВ
3.1. Поиск дополнительных факторов патогенности и иммуноген
ности В. апЖгасй хромосомной детерминации
3.1.1. Изучение феномена популяционной гетерогенности штаммов В. апкгааз по экспрессии хромосомных признаков
3.1.2. Выяснение влияния отдельных спонтанных хромосомных мутаций на вирулентность В. апМгаЫя
3.1.3. Экспериментальная оценка влияния экспрессии протеолитической активности на иммуногенность штаммов возбудителя сибирской язвы
3.2. Получение набора спонтанных ииндуцированных мутантов
В. апВггасй с нарушенной способностью к образованию спор 2 ГЛАВА 4. ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ БЕЖОВ БСЛОЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ
4.1. Селекция эффективных продуцентов белка Бслоя Бар
4.2. Получение очищенных препаратов белков Бслоя сибиреязвенною микроба
4.3. Идентификация выделенных белков в качестве компонентов Бслоя В. апЖгаЫз
4.4. Определение иммуногенного потенциала белков Бслоя возбудителя сибирской язвы
ГЛАВА 5. КОНСТРУИРОВАНИЕ БАЦИЛЛЯРНЫХ ШТАММОВ С КЛОНИРОВАННЫМ ГЕНОМ СИНТЕЗА ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕНА СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА
5.1. Разработка подходов к созданию рекомбинантных штаммов, продуцирующих протсктивный антиген В. апЖгаси
5.2. Конструирование гибридных плазмид, содержащих ген
5.3. Получение стабильных рекомбинантных штаммов с высокой
продукцией протективного антигена сибиреязвенного микроба
ГЛАВА 6. КОНСТРУИРОВАНИЕ АСПОРОГЕННОГО РЕКОМБИНАНТНОГО ШТАММАПРОДУЦЕНТА ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕНА СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА
6.1. Получение стабильного аспорогенного рекомбинантного штамма В. апОггасБ, продуцирующего протективный антиген
6.2. Оптимизация технологии выделения и очистки протективного антигена из аспорогенного рекомбинантного штамма В. апйгаш
ГЛАВА 7. ПЕРСПЕКТИВЫ ПРАКТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ БАЦИЛЛЯРНЫХ ШТАММОВ И СИНТЕЗИРУЕМЫХ ИМИ ИММУНОГЕНИЫХ АНТИГЕНОВ
7.1. Оценка иммунологической эффективности рекомбинантных штаммов с клонированным геном ра
7.2. Характеристика защитных свойств рекомбинантного протективного антигена
7.3. Перспективы практического использования белков Бслоя возбудителя сибирской язвы, рекомбинантных штаммов В. апкгаш и синтезируемого ими протективного антигена
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
Введение
Актуальность


Область, ответственная за связывание с ПА, расположена на конце белковой молекулы, а структуры, ответственные за проявление токсичности в Стерминальной части i С. ЛФ расщепляет аминокислотные последовательности i iv i i i, инактивируя сигналы интермедиатов, необходимых для формирования иммунного ответа. ЛФ оказывает повреждающие воздействие на различные иммунные клетки макрофаги, нейтрофилы, Т и лимфоциты, блокируя процессы пролиферации, продукции цитокинов и иммуноглобулинов X . Механизм действия сибиреязвенного токсина заключается в следующем рис. Вначале ПА взаимодействует на поверхности эукариотических клеток с высокоаффинными рецепторами. Количество рецепторов на одну клетку может колебаться в пределах от до 0 единиц i . Затем фурин расщепляет молекулу ПА на две части ПА и ПА. ОФ или ЛФ. Это один из решающих моментов в развитии интоксикации. Видоизмененный искусственным путем ПА, лишенный сайта протеолитического расщепления, становится нетоксичным для макрофагов при совместном использовании с ЛФ . Оставшийся на клеточнойповерхности фрагмент ПА олигомеризуется с образованием гептамера, с ним конкурентно взаимодействуют ЛФ и ОФ. К одному гептамеру может присоединиться до 3 молекул ЛФ иили ОФ . Образовавшийся комплекс проникает в цитоплазму клетки посредством рецепторопосредованного эндоцитоза. В условиях кислого так называемая препора превращается в пору, происходит ее погружение в клеточную мембрану, что создает возможность для транслокации ЛФ и ОФ в цитозоль К. На финальной стадии ЛФ и ОФ реализуют свое цитотоксическое действие. Рисунок 1. Схематическое изображение механизма действия сибиреязвенного токсина М. Синтез компонентов токсина сибиреязвенного микроба детерминируется генами, входящими в состав плазмиды X i . Структурные гены , и , кодирующие соответственно ПА, ОФ и ЛФ, клонированы Vi М. Т., . V. . Транскрипция гена осуществляется с открытой рамки считывания протяженностью п. ПА 5 аминокислотных остатков. Т. . Р1, являющийся Синдуцибельным и находящийся под iуляторным влиянием гена x и второстепенный Р2 конститутивный, независящий от трансактивирующего фактора. Т. а определили, что оба промотора инициируют транскрипцию мРНК различнойпротяженности. Под контролем первого промотора происходит транскрипция ДНК 2,7 т. РНК 4,2 т. А и ген репрессора аоперона . Протеины ОФ и ЛФ кодируются открытыми рамками считывания протяженностью п. ПА. В г. ДНК плазмиды X, выделенной из штамма В. В составе высокомолекулярного репликона п. I элементами и содержащий гены, кодирующие синтез и регуляцию факторов вирулентности сибиреязвенного микроба структурные гены А, , и су а позитивный x и негативный регулоны оперон прорастания спор X. Удаление оперона X приводит к снижению вирулентности мутантных клеток для мышей iii . Присутствие Iэлементов на X позволило предположить, что остров патогенности, как. X, детерминирующих ферменты рекомбинационных процессов и, возможно, вовлеченных в горизонтальный перенос генов. СОгзависимого транскрипционного регулятора x. В дальнейшем было установлено, что x осуществляет координированную регуляцию транскрипции генов, суа и а кодирующий его ген x располагается на плазмиде X между и суа . I. . Активатор экспрессии генов. I. . Транскрипция самого гена x не зависит от присутствия. СОг. Предполагается,, что СО2 влияет на трансляцию мРНК x илина функционирование белка. Физиологическим регулятором экспрессии гена x является температура С i. Схожая с x организация регуляторов транскрипции обнаружена и у других патогенов. По мнению некоторых авторов, x мог бы стать парадигмой нового класса ре1уляторов вирулентности . Трансактиваторный белок x, помимо регуляции транскрипции генов сибиреязвенного токсина, контролирует экспрессию генов, отвечающих за синтез капсулы i . I. . Таким образом, x осуществляет глобальную координацию плазмидных X и рХ и хромосомных генов, определяя уровень и начальный момент их синтеза . На плазмиде X обнаружен также ген 0 п. Т., . Его транскрипция находится под контролем СОгнезависимого Р2промотора. Инактивация приводит к повышению экспрессиигена , продукция ПА увеличивается в этом случае в 2 3 раза i .