Оценка генетического разнообразия фитопатогенных бактерий рода Xanthomonas и разработка молекулярных маркеров для их диагностики

• Автор: Пунина, Наталия Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 188 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗОВАННЫХ В РАБОТЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1.1. Фитопатогенные бактерии рода ХаМИотопая.

1.1.1. Бактерии рода ХаЫИотопав.

1.1.2. Систематика бактерий рода ХашИотопах

1.1.3. Генетическая изменчивость бактерий родаХаткотопаэ.

1.1.4. Патоварианты видов X. сотрем, X. ii и X агЬопсо1а как примеры

разного состава таксонов и изменчивости бактерий

Глава 1.2. Методы диагностики фитопатогенных бактерий.

1.2.1. Фенотипические методы.

1.2.1.1. Тесты на патогенность
1.2.1.2. Биохимические методы исследования.
1.2.1.3. Методы серотипирования и изоферментного анализа
1.2.2. Генотипические биомолекулярные методы диагностики.
1.2.2.1. Определение содержания гуанина и цитозина в молекуле ДНК
1.2.2.2. ДНКДНК и РНКДНК гибридизация нуклеиновых кислот
1.2.2.3. Методы ДНК фингерпринтинга.
1.2.2.4. ПЦР со специфичными праймерами.
1.2.4.5. Методы, основанные на анализе первичных последовательностей нуклеиновых кислот
1.2.3. Интегральная диагностика
1.2.4. Ген субъединицы Б фермента ДНК гиразы.
1.2.5. Цитохром Р0 редуктазы бактерий
1.2.6. Постгрансляционная модификация у патогенных бактерий.
Регион Хсс.
1.2.6.1. Постгрансляционная модификация и модификаторы
1.2.6.2. Регион Хсс0б бактерий рода ХашИотопаз.
ЭКСПЕРИМЕН ТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 2. Материалы н методы исследования
2.1. Объекты исследования
2.2. Изучение физиологических признаков бактерий рода ХатИотопаз.
2.2.1. Проверка вирулентности бактерий
2.2.2. Изучение биохимических свойств бактерий.
2.2.3. Статистическая обработка данных.
2.3. Условия культивирования бактерий и выделения препаратов ДНК из биомассы
2.4. Генетический анализ
2.4.1. ПЦР с использованием праймеров к гену рРНК и межгенному региону рРНК I.
2.4.2. ПЦР с использованием праймеров к гену
2.4.3. ПЦР с использованием праймеров к гену 0 семейства 4
2.4.4. ПЦР с использованием праймеров к региону Хсс.
2.5. ПЦР с использованием праймеров к гену vX
2.6. Очистка ПЦРпродуктов в агарозе
2.7. Клонирование ПЦРфрагментов
2.7.1. Приготовление компетентных клеток.
2.7.2. Лигирование.
2.7.3. Трансформация клеток нлазмидиой ДНК.
2.7.4. Выделение плазмидной ДИК
2.7.5. Рестрикционный анализ плазмидной ДНК
2.8. Секвенирование фрагментов генов
2.9. Биоинформационный анализ данных
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
Глава 3. Оценка фенотипического физиологического разнообразия бактерий рода X.
3.1. Биохимические свойства изучаемых штаммов X .
3.2. Исследование штаммов на патогенность.
Глава 4. Оценка генетического разнообразия исследуемой коллекции X . и нуклеотидных последовательностей генов,
выбранных в качестве молекулярных маркеров.
4.1. Генетическое разнообразие последовательностей гена рРНК
4.2. Генетическое разнообразие последовательностей I6 рРНК I.
4.3. Модель вероятной вторичной структуры оперона 5 рРНК I.
4.4. Генетическое разнообразие последовательностей гена .
4.5. Генетическое разнообразие нуклеотидных последовательностей Зконца гена
бактерий рода X
4.6. Генетическое разнообразие последовательностей гена для бактерий рода
X . в Российской Федерации.
4.7. Генетическое разнообразие последовательностей региона Хсс.
4.8. Генетическое разнообразие последовательностей гена 0 сем.
Глава 5. Изучение изменения бактериального фенотипа.
Делеция гена авирулентности vX
5.1. Появление расы 6 в результате индуцированной мутации
изолята расы 1 X. i v. г i
5.2. Генетическое изучение индуцированной мутацииделеции гена vX
5.3. Вероятные механизмы встраивания и делении гена vX
X. i v. i
Глава 6. Создание молекулярных маркеров для диагностики X
6.1. Создание молекулярных маркеров для диагностики бактерий
рода X на различных таксономических уровнях
6.2. Проверка специфичности системы праймеров XX
для представителей вида X. i
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


X. i тополь Ивовые Дв. X. артишок. Астровые Дв. X. I i дыня огурец Тыквенные Дв. X. iii v. Мальвовые Дв. X. xi спаржа, молочай Спаржевые Молочайные Од. Дв. X. ii гибискус, хлопчатник, мальва цитрусовые Мальвовые, Рутовые Дв. X. бобовые, фасоль Бобовые Дв. X. v сахарный тросник Злаки, или Од. X. i костерь Овсянцевые Од. X. vi сорго, гаолян Злаки Од. X. рис Злаки Од. X. vii томаты Пасленовые Дв. X. аксонопус Злаки, или Мятликовые Од. X. люцерна, бобы, горох Бобовые Дв. X. i томаты паслен, перец Паслновые Дв. X. vii томаты паслен, перец Паслновые Дв. Капустные Дв. Сложноцветные Дв. Капустные, пасленовые Дв. Од однодольные Дв двудольные растения. Геном X . ДНК бактериальной хромосомой длиной 5 М п. Общее количество кодирующих генов 4 тыс. ГЦ состав . К настоящему времени секвенировапы геномы 4х штаммов, относящихся к виду X. X. i v. В0 и X. Полностью секвенировапы геномы видов X. КАСС 1, , X9, X. X. iii 6 X. X. vii X. А и близкородственной бактерии . X ii 9, . Общей чертой для рода X и других патогенных бактерий является присутствие двух классов генов, участвующих в патогенезе генов секреторной системы третьего типа, включая гены iiv i i, ЭПС, ЛПС и геновэффекторов прежнее название vi, i. Они или их продукты позволяют транспортировать бактериальные белки через мембрану хозяина , . Гены эффекторов делятся на несколько классов, присутствующих у бактерий разных родов и видов , iv, , . Продукты одних генов эффскгоров нацелены на генетический аппарат ядро клетки растения i, , где способны модифицировать экспрессию растительных генов, включая гены устойчивости. Другие эффекторы способны прерывать каскад неспецифических защитных реакций растения, вызванных V , . Гены, связанные с патогенностью и вирулентностью бактерий, часто объединены в кластеры, так называемые острова патогенности, расположенные в непосредственной близости к элементам, участвующим в горизонтальном переносе генов и рекомбинационных событиях тРНК, прямым повторам и мобильным элементам i , . Они имеют ГЦ состав, отличный от остального генома , , . По литературным данным известно, что для патогенности бактерий рода X необходимо, примерно, 0 генов, и еще от 0 до 0 генов влияют на уровень е проявления i , . Гены, связанные с патогенностью наличие их определяет агрессивность бактерий рода X, относятся к следующим функциональным категориям гены транспортных систем II X, III Игр, Иге и IV типа i, i, гены эффекторов третьей транспортной системы v, Хор, гены систем детоксикации разрушение ЖК, вторичных метаболитов и дефензинов растения су, , , i , гены трансмембранного транспорта ТопВ и ТопВзависимые рецепторы, гены синтеза ЛГ1С и ЭПС. Специфичность патогенеза определяется, видимо, составом генов эффекторов, системой детоксикации Р0 и селекцией основных ЛПС, ЭПС, флагеллина, триггерфактора, фактора элонгации для ухода от взаимодействия с рецепторами нсспецифичсской иммунной системы растения. Хотя патогенез и контролируется небольшим числом генов 6 всех кодирующих генов генома всего один или несколько локусов определяют генетическую совместимость растенияхозяина и патогена в системе отношений геннаген , i , . Согласно базовой теории фитопатологии геннаген взаимодействия , , цит. Продукты гена располагаются в районе клеточной мембраны, в то время как белки авирулентности т. При взаимодействии рецептора и лиганда в клетке растения активируются каскады ответных реакций, и возникает гиперчувствительная реакция I, . Отсутствие, по меньшей мере, одного из двух комплементарных генов приводит к развитию заболевания у растения Рис. Рис. Генетическая модель специфического взаимодействия патогена и растения i , . В современном виде модель геннаген отношений получила название зигзага i , и включает на первом этапе вызывающее неспецифический защитный эффект взаимодействие между неспецифическими микробными компонентами i i i i и общими неспецифическими рецепторами иммунной системы растения, i , , , . К числу наиболее изученных относятся секретируемые белки бактерии, н. ЛПС и гликопротеины i ix, .