Особенности иммунного ответа на протективный антиген и летальный фактор B. anthracis: подходы к созданию вакцины нового поколения

• Автор: Белова, Елена Валентиновна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Оболенск
• Количество страниц: 145 с. : ил.

Оглавление

Список сокращений и условных обозначений

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Введение.

2.2. Эпидемиология сибирской язвы.

2.3. Клинические проявления сибирской язвы у людей

2.4. Морфология возбудителя сибирской язвы

2.5. Биохимические свойства.

2.6. Антигенная структура.

2.7. Патогенность возбудителя сибирской язвы

2.8. Токсин.
2.8.1. Отечный фактор.
2.8.2. Летальный фактор.
2.8.3. Протективный антиген.
2.8.4. Механизм действия сибиреязвенного токсина
2.9. Лечение сибиреязвенной инфекции
2 Противосибиреязвенные вакцины
2 1. Живые сибиреязвенные вакцины.
. Химические вакцины.
. Комбинированные вакцины
. Проблемы совершенствования сибиреязвенных вакцин.
2 Моноклональные антитела инструменты исследования
и препараты медицинского назначения
. Получение моноклональных антител.
. Свойства моноклональных антител
. Области применения моноклональных антител
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
3.1. Бактериальные штаммы и генноинжинерные конструкции.
3.2. Экспрессия и продукция рекомбинантных ПА и ЛФ в . i.
3.3. Получение отдельных доменов ПА и ЛФ.
3.4. Выделение нативных ПА и ЛФ
3.5. Получение нетоксичного комплекса ПА7ЛФн и комплекса ПА7ЛФ
3.6. Получение антисывороток к олигомеру ПАбЗЛФн.
3.7. Определение уровня специфичности антител у иммунизированных мышей.
3.8. Получение гибридом
3.8.1. Культивирование миеломной клеточной линии.
3.8.2. Подготовка макрофагального фидерного слоя.
3.8.3. Выделение спленоцитов гипериммунных мышей.
3.8.4. Гибридизация
3.8.5. Селекция гибридных клеток.
3.8.6. Скрининг гибридных клеток продуцентов .
3.8.7. Клонирование гибридных клеток.
3.8.8. Масштабирование гибридом
3.8.9. Культивирование гибридом i viv
3.8 Криоконсервация
3.9. Выделение и очистка моноклональных антител из асцитов.
ЗЛО. Определение специфичности МАТ.
3 Определение индекса аддитивности.
3 Оценка токсиннейтрализующей активности i vi.
3 Анализ нейтрализующей активности антител i viv.
3 Анализ протективной активности отдельных доменов ПА i viv
4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
4.1. Клонирование генов ПА и ЛФ и приготовление конструкций .
4.2. Экспрессия и продукция рекомбинантных ПА и ЛФ в Е. i
4.3. Продукция и характеристика антигенов возбудителя сибирской язвы.
4.4. Получение олигомерного комплекса
4.5. Иммунизация мышей и получение .
4.6. Получение и характеристика моноклональных антител к летальному токсину В. i.
4.6.1. Анализ специфичности моноклональных антител к компонентам сибиреязвенного токсина
4.6.2. Определение подклассовой принадлежности.
4.7. Оценка токсиннейтрализующей активности на клетках линии 4 АЛ i vi
4.7.1. Исследования нейтрализации токсина моноклональными антителами против компонента токсического комплекса возбудителя сибирской язвы.
4.8. Определение доменной специфичности моноклональных антител к сибиреязвенному токсину.
4.8.1. Идентификация доменов протективного антигена
взаимодействующих с моноклональными антителами
4.8.2. Идентификация доменов летального фактора взаимодействующих с моноклональными антителами
4.9. Исследование роли фрагмента в усилении токсического эффекта летального токсина на макрофагоподобную клеточную линию.
4 Определение сайтов связывания моноклональных антител к протективному антигену В. i.
4 Нейтрализующая активность к протективному антигену i
4 Исследование протективной активности отдельных доменов ПА .
4 Изучение структуры иммунного ответа у животных, иммунизированных вакцинным штаммом сибирской язвы СТИ1
5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
6. ВЫВОДЫ.
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Клетки i i в вегетативном состоянии вырабатывают тройной комплекс токсина, который состоит из рецепторсвязывающего компонента, также известного как протсктивный антиген ПА и двух эффекторов, летального фактора ЛФ и эдемафактора . Летальный фактор является единственным токсическим компонентом, который напрямую отвечает за летальный исход сибирской язвы. Поэтому ранняя детекция и или нейтрализация активного ЛФ либо в образцах, полученных от пораженных людей или в бактериальных образцах, выращенных для анализа, имеет первостепенное значение для успешного предотвращения и лечения сибирской язвы. Единственный известный компонент токсина, защитный эффект которого доказан это ПА. Таким образом, логично использовать ПА в качестве принципиального компонента новых вакцин. Несовершенство используемых на данный момент вакцин и возросшая потребность в быстром и мощном терапевтическом средстве, способном нейтрализовать сибиреязвенное поражение, выводят на первый план значение эффективной пассивной иммунотерапии. Пассивная терапия антигенспецифическими антителами и сейчас является значимым дополнением к вакцинации и терапии антибиотиками. Изучить особенности гуморального иммунного ответа на сибиреязвенную инфекцию на модели животных и провести картирование моноклональных антител на летальный токсин В. Сконструировать рекомбинантные штаммы . В. i. Получить и охарактеризовать панель моноклональных мышиных антител к протективному антигену В. Получить и охарактеризовать панель моноклональных мышиных антител к летальному фактору В. Изучить молекулярный механизм, детерминирующий потенцирующее действие мышиных моноклональных антител к протективному антигену В. Определить антигенные детерминанты потенцирующих и блокирующих моноклональных мышиных антител к компонентам сибиреязвенного токсина. Провести изучение действия полученных антител i viv при экспериментальной сибиреязвенной инфекции. Мышиные моноклональные антитела к протективному антигену могут как блокировать, так и потенцировать действие летального токсина В. Моноклональные антитела к протективному антигену, блокирующие действие летального токсина В. IV домену ПА. Моноклональные антитела к протективному антигену, потенцирующие действие летального токсина В. III домену ПА. Механизм потенцирования действия состоит в рецепторном усилении эндоцитоза комплекса летального токсина в чувствительную клеткумишень. Моноклональные антитела к летальному фактору, блокирующие действие летального токсина В. I домену ЛФ. Пассивная иммунизация мышей блокирующими антителами спасает животных при экспериментальной сибиреязвенной инфекции. Показан механизм потенцирования действия летального токсина В. Впервые установлено, что блокирующие и потенцирующие действия летального токсина В. ПА имеют разную эпитопную специфичность. Впервые установлена тонкая структура антигенных детерминант полученных моноклональных антител к 3 домену протективного антигена. Выявлено, что механизм потенцирования действия состоит в рецепторном усилении эндоцитоза комплекса летального токсина в чувствительную клеткумишень. Основные теоретические итоги проделанной работы заключаются в определении особенностей иммунного ответа на протективный антиген и летальный фактор В. Полученные данные свидетельствуют о том, что моноклональные антитела к протективному антигену могут, как блокировать, так и потенцировать действие летального токсина В. Установлен механизм потенцирования действия летального токсина В. Полученные данные о тонкой антигенной специфичности моноклональных антител, обладающих протективным действием как i vi, так и i viv, являются базой для разработки вакцин нового поколения против сибирской язвы в плане создания современных иммунологически эффективных препаратов рекомбинантных компонентов протективного антигена и летального фактора. Структура антигенсвязывающих фрагментов полученных блокирующих антител может быть использована для создания гуманизированных антител для пассивной иммунизации определенных групп населения против сибирской язвы.