Оптимизация методов получения антигенного материала и поликлональных антител для изучения полиморфизма белковых антигенов и идентификации эндомикоризных грибов

• Автор: Козлова, Наталия Валерьевна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 128 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Роль эндомикоризных 1рибов в жизни растений

1.2. Биоразнообразие и идентификация эндомикоризных грибов. Современные методы исследования

1.2.1. Биологическое разнообразие эндомикоризных грибов.

1.2.2. Изучение биоразнообразия и идентификация эндомикоризных грибов с помощью молекулярногенетических методов
и
1.2.3. Использование иммунохимических методов для изучения биоразнообразия и идентификации эндомикоризных грибов
1.2.3.1. Молекулярные основы иммунохимических методов. Поликлональные и моноклональные антитела.

1.2.3.2. Особенности получения антител к антигенам эндомикоризных грибов

1.2.3.3. Использование антител для серогруппирования АМГ и их идентификации в почве и корнях
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Штаммы грибов и условия культивирования
2.2. Получение и поддержание культур iтрансформированных корней и установление эндомикоризного симбиоза i vi
2.3. Определение степени микоризной колонизации корней
2.4.Получение иммунных сывороток и оценка активности антител
2.5. Выделение иммуноглобулинов.
2.6. Определение специфичности антител к поверхностным антигенам почвообитающих грибов.
2.7. Анализ антигенных структур АМГ
2.7.1. Двумерный иммуноэлектрофорез и прибор для его проведения.
2.7.2. Приготовление буфера, агарозных гелей и белковых растворов. Проведение иммуноэлектрофореза.
2.7.3. Визуализация иммунопреципитатов
2.7.4. Характеристика антигенных детерминант
2.7.5. Идентификация изолята АМГ по морфологическим признакам РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ АНТИГЕННОГО МАТЕРИАЛА
3.1. Оптимизация метода очистки везикул эндомикоризных грибов от корней . i.
3.2. Совместное культивирование ii штамма 7 и iтрансформированных корней
ГЛАВА 4. ПОЛУЧЕНИЕ ПОЛИКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ
4.1. Подготовка антигена к иммунизации
4.2. Схема иммунизации
4.3. Специфичность антител к поверхностным антигенам.
ГЛАВА 5. АНАЛИЗ АНТИГЕННЫХ СТРУКТУР
5.1. Общая характеристика выявленных антигенов. Динамика активности антител
5.2. Полиморфизм белковых антигенов эндомикоризных грибов
5.3. Идентификация изолята Оаярога таага с помощью морфологических критериев
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРА ТУРЫ.
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Предложен способ получения поликлональных антител к водорастворимым белкам везикул эндомикоризного гриба ii. Оптимизирован метод получения белковых антигенов АМГ, свободных от растительных примесей. Предложена совокупность приемов подготовки антигена к иммунизации, позволяющая существенно увеличить концентрацию и иммуногенность белков эндомикоризного гриба. Впервые методом двумерного иммуноэлектрофореза проанализирован полиморфизм белковых антигенов эндомикоризных грибов. Показано наличие семи перекрестно реагирующих антигенов для . . i и пяти таких антигенов для . . i. Три антигена были обнаруженных только у . Рассмотренные подхода позволяют изучать биоразнообразие и проводить идентификацию АМГ на качественно новом уровне. Практическая ценность работы. Получены поликлональные антитела, позволяющие изучать поведение и развитие . Идентификация специфичных антигенов методом иммуноэлектрофореза может быть использована для контроля чистоты биопрепарата на основе . О. МгагасИсеБ штамму 7 открывают перспективы для получения антител к другим видам АМГ. Публикации и апробация работы. Материалы диссертации были изложены на второй международной конференции по микоризе Упсала, Швеция, , конференции Проблемы микологии на рубеже веков Москва, , Докучаевских молодежных чтениях Почвы и биоразнообразие СанктПетербург, международной конференции Микология и криптогамная ботаника в России традиции и современность СанктПетербург, . По материалам диссергации опубликовано три работы и две работы принято к публикации. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 8 страницах машинописного текста, содержит восемь таблиц, рисунков. Список использованной литературы включает 9 наименований, в том числе 8 иностранных. ГЛАВА 1. Арбускулярная микориза является самым распространенным симбиозом на Земле и встречается у видов высших растений i . Широкая распространенность и низкая специфичность АМГ и растенияхозяина по отношению друг к другу i, подчеркивают важность роли гриба в жизнедеятельности растения. С точки зрения концепции , , оценивающей пользу симбиоза как вклад в конкурентоспособность партнеров в борьбе за выживание, значимость арбускулярной микоризы очевидна, поскольку АМ1 и часть их растенийхозяев не способны развиваться вне симбиотической ассоциации. Многократно отмечена роль арбускулярной микоризы в стимуляции росла растений, повышении их жизнеспособности и увеличении урожая Муромцев и др. Хрущева и Согина, . i i, . . v . , , i , . . i . , . i iii, . Показано, что наружный мицелий Г способен поставлять растению до фосфора, азота, калия, цинка, меди, а также сульфатионы, молибден и кальций . . . i . i . , . Обнаружена способность стимулировать поступление железа в растение в условиях сниженной концентрации микроэлементов в почве i . Существенный вклад в улучшение минерального питания растений достигается за счет увеличения сорбционной поверхности, активного транспорта ионов , . vi, , а также непрямых эффектов. К таким эффектам можно отнести стимуляцию симбиотической азотфиксации у микоризованных растений i , v . . v . Транспорт минеральных веществ от гриба в растение и углеводов от растения в гриб происходит через специфически модифицированные области контакта, в образовании которых принимаю i . Морфологически области контакта связаны с арбу скулам и кистевидными структурами гриба, формирующимися после проникновения гифы в клетку корня.