Определение множественной лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis молекулярно-генетическими методами

• Автор: Галкина, Ксения Юрьевна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 109 с. : ил.

Введение

Глава 1. Обзор литературы.

1.1.Современные бактериологические методы определения чувствительности i i к противотуберкулезным препаратам.

1.1.1 .Определение чувствительности i i к противотуберкулезным препаратам на

плотных средах

1.1.2.0пределение чувствительности i i к противотуберкулезным препаратам на жидких средах.

1.2. Молекулярные механизмы множественной лекарственной устойчивости i i

1.2.1. Устойчивость к рифампицину.

1.2.2. Устойчивость к изониазду.

1.3. Молекулярнобиологические методы определения мутаций, ведущих к становлению резистентности i i к противотуберкулезным препаратам

1.3.1 Секвенирование ДНК

1.3.2. Метод денатурирующего градиентного гель электрофореза i i i
1.3.3. Метод несовершенного дуплекса СМС i i v.
1.3.4. Метод гетеродуплексного анализа ПЦР ГДА
1.3.5. Метод выявления мутаций, приводящих к полиморфизму длин рестрикционных фрагментов ДНК ПДРФ ii i .
1.3.6. Обнаружение мутаций путем оценки конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК i i i .
1.3.7. Определение ЛУ МБТ методом гибридизации на олигонуклеотидном микрочипе
Глава 2. Материал и методы исследования.
2.1. Пациенты и клинические образцы.
2.2. Сбор материала.
2.3. Определение лекарственной чувствительности i i
2.3.1. Подготовка проб для ТББИОЧИП
2.3.2. Условия проведения полимеразной цепной реакции.
2.3.3. Проведение гибридизации
2.3.4. Регистрация результатов гибридизации.
2.4. Определение устойчивости к изониазиду путем выявления мутаций в гене методом конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов
2.4.1. Подготовка проб
2.4.2. Условия проведения полимеразной цепной реакции
2.4.3. Выявление мутаций в гене
2.5. Статистическая обработка данных
Глава 3. Собственные исследования
Сравнение эффективности выявления i i, чувствительных и резистентных к рифампицину и изониазиду, методом ТББИОЧИП и бактериологическими методами в культурах и респираторных образцах
3.1. Определение лекарственной чувствительности i i бактериологическими методами
3.2. Оценка эффективности выявления ДНК i i и определения ее чувствительности к рифампицину и изониазиду в респираторных образцах с помощью тестсистемы ТББИОЧИП
3.3. Оценка эффективности выявления ДНК i i и определения ее чувствительности к рифампицину и изониазиду, с помощью ТББИОЧИП в культурах.
3.4. Анализ сочетания мутаций в ДНК i i, выделенных от больных, исследованных с помощью ТББИОЧИП.
3.4.1. Анализ сочетания мутаций в ДНК i i, выделенных от больных с впервые выявленным туберкулезом.
3.4.2. Анализ сочетания мутаций в ДНК i i, выделенных от больных с хроническим течением туберкулеза.
Глава 4. Анализ мутаций в гене i i с помощью метода конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов
4.1 .Выявление мутаций в гене i i, выделенных от больных с впервые выявленным туберкулезом легких, методом
4.2. Выявление мутаций в гене i i, выделенных от больных с хроническим течением туберкулеза, методом
Заключение
Список литературы.
Список сокращений
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
ЛУ лекарственная устойчивость
лч лекарственная чувствительность
лй ЛевенштейнаЙенсена плотная питательная среда
МБТ i i
МИК минимальная ингибирующая концентрация
МЛУ множественная лекарственная устойчивость
МНПЦБТ Московский научнопрактический центр борьбы с туберкулезом
п.н. пары нуклеотидов
МП метод пропорций
НАД никотинадеиозиндифосфат
НАДН никотинаденозиндифосфат с ионом водорода
птп противотуберкулезные препараты
ПЦР полимеразная цепная реакция
РНК рибонуклеиновая кислота
СЖС система синтеза жирных кислот
Введение
Актуальность


Согласно статистическим данным в Москве в году i i с множественной лекарственной устойчивостью обнаружены у 7,6 больных с впервые выявленным туберкулезом легких и у ,2 пациентов с хроническим течением заболевания . Микробиологические методы диагностики и определения лекарственной чувствительности i i являются достаточно точными и надежными, однако, получить видимый рост возбудителя на плотной питательной среде возможно только через недель, что существенно замедляет процесс верификации диагноза. Для определения лекарственной чувствительности на плотной среде ЛевенштейнаЙенсена требуется еще недели, в связи с чем, выбор обоснованного режима химиотерапии откладывается на месяца, а назначение противотуберкулезных препаратов чаще всего носит эмпирический характер. Для сокращения времени культуральной диагностики туберкулеза были разработаны автоматизированные бактериологические системы ВАСТЕС I0 ii и iix, в которых рост микобактерий происходит на жидкой питательной среде. Внедрение во фтизиатрию молекулярнобиологических методов дало возможность существенно сократить сроки определения лекарственной чувствительности микобактерий. В настоящее время известны гены i i, кодирующие ферменты, которые взаимодействуют с лекарственными препаратами, и появление мутаций в этих генах приводит к становлению резистентности к противотуберкулезным препаратам 1,,,. Молекулярнобиологические методы обладают высокой точностью и надежностью и многие из них позволяют не только выявить, но и охарактеризовать мутации, возникшие в геноме микобактерий. Методы определения мутаций различны. Как правило, они совмещают в себе клонирование исследуемого участка гена путем полимеразной цепной реакции и детекции полученных ампликонов путем прямого секвенирования ПЦРпродукта, определения полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ii i , электрофореза продуктов ПЦР в денатурирующем градиентном геле i i i гетеродуплексного анализа, исследования конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов i i i . Большинство из указанных выше методов применяются, главным образом, в научных целях, хотя их адаптация, в частности метода , возможна для специализированных лабораторий, занимающихся ПЦРдиагностикой. Принципиально новая, не имеющая аналогов тестсистема ТББИОЧИП, разработанная в Институте молекулярной биологии им. В. А. ПЦР и гибридизацию на микрочипе. На второй стадии амплификации используется праймер, меченый флуоресцентной меткой 5. Полученный меченый ПЦРпродукт подвергается гибридизации. Микрочип представляет собой небольшое стекло, на которое иммобилизуют в виде правильно расположенных микроячеек небольшие фрагменты ДНК с известной последовательностью нуклеотидов. Данные ячейки объединены в группы таким образом, что сравнение интенсивности флуоресцентных сигналов ячеек каждой группы позволяет сделать заключение о наличииотсутствии мутации минорного полиморфизма, приводящей к замене одного аминокислотного остатка. Интерпретация результатов гибридизации осуществляется при сравнении интенсивности флуоресцентных сигналов в ячейках, принадлежащих к одной группе. Максимальный флуоресцентный сигнал свидетельствует о наличии совершенного гибридизационного дуплекса 8. Данная тестсистема позволяет детектировать типов мутаций по гену гроВ и типов мутаций по генам i, x и i. С помощью этого чипа удается выявить всех случаев наличия микобактерий с множественной лекарственной устойчивостью у обследуемых больных туберкулезом. Каждый этап адаптирован для условий молекулярнодиагностических лабораторий, метод не трудоемок и занимает часов . Известно, что 5,8 штаммов возбудителя, резистентных к изониазиду, имеют мутации в гене , , . Поскольку использование мультиплексной полимеразной цепной реакции ограничивает количество анализируемых генов на микрочипе, для выявления мутаций в гене , можно использовать метод . Сочетание метода биологических микрочипов ТББИОЧИП и позволяет охарактеризовать i i по пяти наиболее изученным генам, определяющим наличие множественной лекарственной устойчивости.