Новые анаэробные термофильные прокариоты и их гидролитические ферменты

• Автор: Кубланов, Илья Валерьевич
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 147 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Термофильные микроорганизмы и их ферменты термозимы

1.1. Экстрсмофилы

1.2. Термальные местообитания и термофилы

1.3. Термозимы ферменты термофильных микроорганизмов

1.4. Механизмы, обуславливающие стабильность белков

1.5. Термостабильные гидролазы

1.5.1. Амилазы

1.5.2. Целл юл азы

1.5.3. Ксиланазы
1.5.4. Хитиназы
1.5.5. Агаразы
1.5.6. Эстеразы и липазы
Глава 2. Протсолитики и протеазы
2.1 Природные белковые полимеры как субстраты протеаз
2.2. Общие сведения. Классификация
2.3. Термофильные протеолитики и их протеазы
2.3.1. Протсиназы термофильных бактерий
2.3.2. Протсиназы термофильных архей
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ Ч АСТЬ Методы
Глава 3. Микробиологические методы
3.1. Отбор образцов и полевые работы
3.2. Культивирование термофильных прокариот в
лабораторных условиях
3.3. Выделение чистых культур
3.4. Микроскопия
3.5. Оценка скорости роста
3.6. Определение продуктов роста исследуемых штаммов
Глава 4. Методы работы с ДНК и филогения
4.1. Выделение ДНК
4.2. Амплификация фрагментов генов, кодирующих 8 рРНК
4.3. Детекция продуктов ПЦР
4.4. Денатурирующий градиентный гель электрофорез ДГГЭ
4.5. Ссквенирование ПЦРфрагментов и анализ нуклеотидных последовательностей
4.6. Филогенетический анализ исследуемых последовательностей
Глава 5. Методы исследования протсолитических ферментов
5.1. Приготовление образцов протеиназ
5.2. ДСНПААГ электрофорез и зимограммы
5.3. Гидролиз казеина
5.4. Определение характеристик исследуемых кератиназ
5.5. Гидролиз Вцепи инсулина исследуемыми кератиназами
5.6. Очистка кератиназы из СаШапаегоЬаМег го1ео1уИси
штамм 1
5.7. Определение концентрации белка Результаты и обсуждение
Глава 6. Разнообразие термофильных прокарнотгидролитиков
в горячих источниках кальдеры Узон
6.1. Фенотипическое разнообразие термофильных
прокариотгидролитиков в горячих источниках кальдеры Узон
6.2. Филогенетическое разнообразие термофильных прокариотгидролитиков в горячих источниках кальдеры Узон
6.3. Протеолитическая активност в накопительных культурах
Глава 7. Выделение и описание анаэробных термофильных микроорганшмовгидролитиков
7.1. i . штаммы 1 и 9
7.2. ii i штамм 8 и ii i штамм
7.3. i штамм 1
7.4. . штамм
7.5. ii штамм
7.6. i штамм
Глава 8. Определение гидролитических активностей новых изолятов
8.1. Целлюлазы из iii штамм 8, ii i штамм и i . штамм 1
8.2. Протеиназа из i штамм 2
8.3 Рост штаммов 1 и на белках, включаяя кератины,
и продукция ими внеклеточных нротенназ
8.4. Определение кератинолитичсской активности i штамм 1 и . штамм
8.5. Специфичность кератиназ 1 и
8.6. Зависимость активности кератиназ 1 и от Т и
8.7. Физикохимические свойства кератиназ 1 и
8.8. Очистка кератиназы 1
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
Список сокращений Список литерату ры
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Таким образом, поиск новых термофильных микроорганизмовгидролитиков остается актуальной проблемой исследований как с научной, так и с прикладной точки зрения. Целью работы было обнаружение, выделение и изучение анаэробных термофильных микроорганизмовгидролитиков, а также их ферментов. Изучение филогенетического разнообразия термофильных микроорганизмовгидролитиков из горячих источников кальдеры Узон. Выделение и характеристика чистых культур анаэробных термофильных гидролитиков. Характеристика термостабильных гидролитических ферментов, продуцируемых новыми изолятами. Опробованный метод культивирования накопительных культур в условиях i i с добавлением различных нерастворимых и слаборастворимых биополимерных субстратов является действенным методом накопления новых гидролитических микроорганизмов. Определение филогенетического положения наиболее многочисленных микроорганизмов, населяющих полевые накопительные культуры, показало, что в них, помимо представителей уже известных родов бактерий, присутствуют термофильные археи, ранее известные исключительно по природным клонам. Выделены и охарактеризованы новые целлюлолитические термофильные бактерии ii i и i . Показана способность протеиназ из i и . Такие свойства обеих кератиназ как активация додсцилсульфатом натрия ДСН, а также остаточная активность в присутствии растворителей, являются новыми для термофильных кератиназ. Выделенные нами кератиназы ввиду их исключительной активности в присутствии ДСН могут найти широкое применение в качестве добавок к моющим средствам, также привлекательна возможность их использования в качестве биодеградирующих агентов различных трудногидролизуемых белков, таких как кератины. Материалы диссертации были представлены на международных конференциях Биоразнообразие и функционирование микробных сообществ водных и наземных систем Центральной Азии, i xi Международная конференция по физикохимической биологии, посвященная летию со дня рождения академика Ю. А. Овчинникова, i, iivi, i iii i, Химия протсолитичсских ферментов, . Работа выполнялась в лаборатории гипертермофильных микробных сообществ Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН и в лаборатории функций и взаимодействий белков молока I Национального Института сельскохозяйственных исследовании I, г. Нант при докторантуре Университета Нанта, Франция. Л.В. Лебединским ИНМИ РАН. Выделение ДНК, проведение ПЦР и ДГГЭ анализ генов рРНК были выполнены совместно с сотрудниками лаборатории Переваловой и к. Г.Б. Слободкиной. Определение состава ГЦ пар в ДНК и ДНКДНК гибридизацию выполняли совместно с к. А.М. Лысенко и к. Черных ИНМИ РАН. Определение последовательностей генов рРНК и филогению чистых культур выполняли совместно с к. Б.Б. Кузнецовым, к. Т.В. Колгановой Центр Биоинженерии РАН. Электронную микроскопию накопительных и чистых культур проводили совместно с Кострикиной ИНМИ РАН. Массспектрометрию, ВЭЖХ хроматографию и др. Исследования свойств ферментов проводили при содействии М. Датгаларрондо М. I, , а также сотрудников лаборатории химии протеолитических ферментов ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН. Румша Л. Автор приносит искреннюю благодарность всем коллегам, принимавшим участие на различных этапах работы Лебединскому, Переваювой, Г. Б. Слободкиной, М. Л. Мирошниченко, А. М. Лысенко, Черных, Кострикиной, М. И. Прокофьевой, К. И. Мишариной, К. Б. Цирульникову, С. Х. Биджневой, Б. Б. Кузнецову, Т. В. Колгановой и М. Далгаларрондо а также сотрудникам лаборатории гипертермофильных микробных сообществ ИНМИ РАН, Россия и лаборатории функций и взаимодействий белков молока I, Нант, Франция, за помощь в данной работе, а также за создание замечательной, способствующией рабочей и творческой дейтельности, атмосферы. Автор благодарит посольство Франции в Москве за предоставленную стипендию во время прохождения докторантуры в Университете Нанта. Автор благодарит Льва Давидовича Румша за критические и справедливые замечания, а также Алину Княжснцсву за исправление множества ошибок, скрывшихся от взгляда автора.