Молекулярная детекция представителей гипертермофильных архей и характеристика архейной термостабильной ДНК-полимеразы

• Автор: Слободкина, Галина Борисовна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 118 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Гипертермофильные микроорганизмы

1.1. Места обитания гипертермофилов

1.2. Физиологические свойства гипертермофилов

1.3. Филогения и таксономия гипертермофилов

2. Род

2.1. Таксономия и места обитания

2.2. Генотипическое разнообразие

2.3. Фенотипические свойства

3. Возможности промышленного использования ферментов гипертермофилов 3.1 Термостабильные ДНКполимеразы
4. Молекулярные методы в микробной экологии
4.1. Роль молекулы рРНК в современной таксономии и филогении
4.2. ПЦРклонированиесеквенирование основная магисграль молекулярною анализа микробных сообществ
4.2.1. ПЦР со специфичными праймерами
4.3. Электрофорез в денатурирующем градиентном геле
4.4. I i гибридизация
4.5. Недостатки методов микробной молекулярной экологии 4.6 Сочетание методов классической и молекулярной микробной экологии
РЕЗЮМЕ
II. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. ГЩРдетскиия гипертермофильных архей семейства
1.1.Специфичность праймеров 9
1.2. Чувствительность метода
1.3. Идентификация чистых культур микроорганизмов
1.4. Детекция представителей в природных образцах и накопительных культурах
2. ПЦРдетекция архей в гипертермофильной накопительной культуре, полученной из метантенка, работающего в термофильном режиме
2.1. Получение культуры гипертермофильных микроорганизмов
2.2. ПЦРаиализ накопительных культур
2.3. Амплификация и еиквенс архейных генов Б рРНК
2.4. Физиологические характеристики роста КР4
3. Выделение и характеристика архейной термостабильной ДНКполимеразы
3.1. Скрининг коллекции гипертермофильных архей на наличие термостабильных ДНКполимераз
3.2. п нш характеристика отобранных архейных термостабильных полимераз
3.3. Выделение и очистка ДНКполимеразы из штамма
ТНегтососст эр Б И1АМ
3.4. Молекулярная масса и гермостабильность очищенной ДНКполимеразы
3.5. Способность к ПРамплификации ДНК
3.6. Характеристика З5экзонуклсазной активности
3.7. Определение частоты ошибок выделенной ДНКполимеразы
4. Клонирование гена ДНКполимеразы из штамма ТИегтососсш зр. БЫАМ
5. Экспрессия гена ДНКполимеразы из ТИегтососсин р. БЫАМ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


, vv, i. . i . V., i . ., . ., v . ., . . . ii ix ii i i ii. . I. xi. , , . . , . i . ., i I. V., i . V., i . I., v . ., . . . i iiii ii i . . I. xi. , , , I. . , . ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1. Отличительной чертой гипергермофильных микроорганизмов является способность к росту мри высоких температурах выше С. Некоторые из них настолько хорошо адаптированы к высоким температурам, что не растут при температуре ниже С , . Современные эволюционные теории предполагают, что, возможно, именно I инертермофильные прокариоты были первыми формами жизни, появившимися на Земле , . Исследования гииертермофильных микроорганизмов определяют и расширяют наши представления о верхней температурной границе жизни. В году оптимальную температуру роста бактерии i С, считали экстремально высокой , . Зафиксированные в настоящее время наивысшие температуры роста составляют 3С ii . ГС ii i v, . Поиск белков, специфичных для гипертермофилов, среди имеющихся в настоящее время полных геномных сиквенсов привел к удивительному результату. Оказалось, только один белок обратная гираза присутствует у всех гипертермофилов у некоторых кренархсот их даже два и отсутствует у мезофильных и термофильных микроорганизмов , . Этот фермент предотвращает раскручивание двойной спирали молекулы ДНК при высоких температурах и поддерживает ее в функциональном состоянии. Сохранение функциональноактивной ДНК было абсолютно необходимо для первых микроорганизмов, преодолевших Я0градусный температурный барьер. В недавней работе Аюгш щ а1. ТИегтососсия кос1акагаепя1я К. СЮ1 не приводило к летальному исходу при УС. Однако ДНК штамма, лишенного этого гена не была положительно суперскрученной, и рост его был замедлен по сравнению с нормальным штаммом, что было особенно ярко выражено при более высоких температурах. Гинертермофильные микроорганизмы были выделены почти исключительно из биотонов с температурами от С до 5С. Естественными местами обитания гииертермофилов являются зоны гидротермальной активности вулканического происхождения, такие как наземные сольфатары и г орячие источники, геотермально нагреваемые морские осадки и вода, мелководные и глубоководные гидротермы. В зонах активного вулканизма создаются особые гидрогеологические условия и возникают уникальные природные термальные растворы. Это открытые по флюидному компоненту системы, характеризующиеся высокой скоростью протекающих в них процессов преобразования вещества, для которых обязательной является связь с магматизмом. Химический состав гидротермальных растворов связан через флюид с химическим составом магматического очага и через метеорные воды с атмосферой. Изменение физикохимических параметров растворов по мерс их фильтрации к поверхности создает геохимические барьеры Перельман, , служащие местом развития микробных сообществ. Термофильные микроорганизмы используют магматические газы, теряемые Землей, основными компонентами которых ЯВЛЯЮТСЯ Н2, Н2О, СИ4, СО, СО2 и соединения серы. Морские гидротермальные системы имеют ряд характерных особенностей, отличающих их от наземных. Прежде всего, они отделены от атмосферы океаном, вода которого несет в себе кислород и сульфаты. Морская вода, проходя через трещины океанической коры, претерпевает ряд изменений и превращается в агрессивный восстановительный флюид. Базальты, из которых состоит океаническая кора, подвергаются воздействию агрессивного флюида.