Создание высокоспецифичных амплификационных тест-систем для детекции возбудителей туберкулеза, чумы, холеры, герпеса и гепатита A

• Автор: Альтшулер, Михаил Львович
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 138 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ

1.1.1. ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПЦР

1.1.1.1. Структура и совместимость праймеров

1.1.1.2. Денатурация ДНКматрицы.

1.1.1.3. Температура отжига праймеров

1.1.1.4. Количество циклов амплификации

1.1.2. ЗНАЧЕНИЕ ПЦР ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ МУТАЦИЙ И АЛЛЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ

1.1.2.1. Обзор методов детекции мутаций в ПЦР

ОРАГМЕНТАХ .
1.1.2Л.1. Полный анализ нуклеотидной последовательности, проводимый с помощью
ссквсннровання. .
1. 1.2.1.1.1. Определение нуклеотидной
последовательности методом ссквспирования по Сейгеру
1.1.2.1.1.2. Секссниросапие, основанное на гибридизации.
1.1.2.1.2. Методы, направленные на идентификацию
отличим в нуклеотидной последовательности или па определение шбраннмх мутаций
1.1.2.1.2.1. Конформационные методы
1.1.2.1.2.1.1. Метод, основанный на локальном плавлении ДНК
1.1.2.1.2.1.2. Гстсродуплексный анализ.
1.1.2.1.2.1.3. Конформаиионночувствнтельный электрофорез п агарозе
1.1.2.1.2.1.4. Конфор.мациоииый полиморфизм однонитсвых фрагментов ДНК
1.1.2.1.2.2. Лигазная цепная реакция.
1.1.2.1.2.3. Гивриднзация и микрочипы
1.1.2.1.2.4. Использованиерестрикции для детекции мутаций.
1.1.2.1.2.5. Л
1.1.2.1.2.6. Использование белков, узнающих нскомтсментарности
1.1.2.1.2.7. Химическое расщстсние нскомплсментариостсй
1.1.2.1.2.8. Метод молекулярныхмаяков
1.1.2.1.2.9. Апельспецифическая аитификация
1.1.3. ПРЕИМУЩЕСТВА ГНЕЗДОВОГО МЕТОДА
ПРОВЕДЕНИЯ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
1.2. АНАЛИЗ ГЕНА КАК МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ К РИФАМПИЦИНУ У I I.
1.3. ОПАСНОСТЬ ИНФИЦИРОВАНИЯ ВИРУСОМ ГЕРПЕСА И ЗНАЧЕНИЕ ЛАБОРАТОРНЫХ МЕТОДОВ В ЕГО ДИАГНОСТИКЕ
1.4. ПРИМЕНЕНИЕ ПЦР ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ.
1.4.1. АКТУАЛЬНОСТЬ ВЫЯВЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ В УСЛОВИЯХ СОВРЕМЕННОГО ОБЩЕСТВА
1.4.2. ВЫБОР ГЕНЕТИЧЕСКОЙ МИШЕНИ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ II I.
1.5. ХОЛЕРНЫЙ ЭНТЕРОТОКСИН КАК ФАКТОР ВИРУЛЕНТНОСТИ И МИШЕНЬ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ
1.6. РАСПРОСТРАНЕННОСТЬ ГЕПАТИТА А И ЗНАЧЕНИЕ ПЦР В ЕГО ДИАГНОСТИКЕ.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2.1. БАКТЕРИАЛЬНЫЕ И ВИРУСНЫЕ ШТАММЫ, ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ, ИСТОЧНИКИ КЛИНИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ
2.2. ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК И РНК
2.1.2.1. Выделение ДНК из М. i.
2.1.2.2. Выделение РНК вируса гепатита А
2.1.2.3. Выделение ДНК У. i, V. и
вируса герпеса
. ПРАЙМЕРЫ ДЛЯ ПЦР
2.4. ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР И СОВМЕЩЕННЫХ РЕАКЦИЙ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ С ПЦР
2.5. СЕКВЕНИРОВАНИЕ ГЕНА I I
2.6. АЛЛЕЛЬСПЕЦИФИЧЕСКАЯ АМПЛИФИКАЦИЯ.
2.7. АНАЛИЗ КОНФОРМАЦИОИНОГО ПОЛИМОРФИЗМА .
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ К РИФАМПИЦИНУ У I I 3.1.1. ХАРАКТЕРИСТИКА СПЕКТРА МУТАЦИЙ, ОБУСЛАВЛИВАЮЩИХ УСТОЙЧИВОСТЬ К РИФАМПИЦИНУ.
3.1.2. РАЗРАБОТКА УПРОЩЕННОЙ МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МУТАЦИЙ УСТОЙЧИВОСТИ К РИФАМПИЦИНУ НА ОСНОВЕ КОНФОРМАЦИОННОГО ПОЛИМОРФИЗМА И АЛЛЕЛЬСПЕЦИФИЧЕСКОЙ АМПЛИФИКАЦИИ
3.1.3. ВЫЯВЛЕНИЕ ЗНАЧИМОСТИ РЕДКИХ МУТАЦИЙ.
3.1.4. ВОЗМОЖНЫЕ ПУТИ РЕШЕНИЯ ПРОБЛЕМЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МУТАЦИЙ В ПЦРПРОДУКТАХ.
3.2. РАЗРАБОТКА ОПТИМАЛЬНЫХ УСЛОВИЙ ПРОВЕДЕНИЯ ПЦР ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ II ИСПЫТАНИЕ СОЗДАННОЙ ТЕСТСИСТЕМЫ НА КОЛЛЕКЦИОННЫХ ШТАММАХ.
3.3. СОЗДАНИЕ ТЕСТСИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ ГНЕЗДОВОЙ ПЦР ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ДНК VII И ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ АНАЛИЗА ВИРУЛЕНТНОСТИ ВИБРИОНОВ
3.4. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГНЕЗДОВОЙ ПЦР ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСА ПРОСТОГО ГЕРПЕСА ЧЕЛОВЕКА IIIII ТИПА IIV1 IIV2.
3.5. ИСПЫТАНИЕ ТЕСТСИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ
ПЦР ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ РНК ВИРУСА ГЕПАТИТА А
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
x
ЛТФ англ. АТРадсиозннтрнфосфорная кислота
ИФЛ иммуноферментный анализ
МКК монопопуклсариыс клетки крови
НЦР англ. полимеразная цепная реакция
А п гп и и с к i а
А адснии
I алснозинтрнфосфорная кислота
i i Базовый инструмент поиска сходства последовательностей, основанный на принципе локального сопоставления
Ьр нуклеотидная парапара комплементарных нуклеотидов, находящихся напротив друг друга в двух цепях ДНК Сцитозин
V цитомсгаловирус I дезоксиадсиозинтрифосфорная кислота дсзоксицитиднмтрифосфориая кислота дсзоксигуанозинтрифосфорная кислота дсзоксптимндипгрифосфорная кислота V вирус ЭиштейиаБарра гуанин
IIV вирус гепатита А
IIВV вирус гепатита В
II V6 вирус герпеса тина VI
IV1 вирус иммунодефицита человека типа I
V1 вирус простого герпеса человека I типа
V2 вирус простого герпеса человека II типа IIV1 Тлимфотроппыи вирус человека типа I IIV вирус герпеса зостср
I i i Ii Государственныи Центр Биотехнологической Информации, США
совмещенная реакция обратной транскрипции ПЦР
доденилсульфат натрня
i i i конформационнын полиморфизм олнонитсвых фрагментов ДНК
Т тимин
ВВЕДЕНИЕ
1. Актуальность проблемы.
Важнейшим элементом диагностики инфекционных болезней, бактерионосительства, санитарного контроля, экологического мониторинга окружающей среды является детекция инфекционного агента. Среди способов определения возбудителей главенствуют классический микробиологический и иммуноферментный методы. В последнее время в диагностике микрорганизмов применяют выявление специфического фрагмента нуклеотидной последовательности возбудителя, который можно идентифицировать, используя как индикатор его наличия, способность к воспроизведению i vi в присутствии ДНКполимеразы, праймеров и дсзоксирибоиуклеотидов. Этот процесс, подобный процессу естественной репликации хромосом и отличающийся от него исключительно быстрым экспоненциальным накоплением короткого фрагмента ДНК, называется полимеразной цепной реакцией ПЦР 4.
По чувствительности, быстроте, простоте и дешевизне ПЦР сопоставима с иммуноферментным анализом пли даже превосходит его. В некоторых, случаях ПЦР оказывается предпочтительным или единственно возможным методом детекции возбудителя.
Актуальность


МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Выделение ДНК из М. Выделение ДНК У. АЛЛЕЛЬСПЕЦИФИЧЕСКАЯ АМПЛИФИКАЦИЯ. АНАЛИЗ КОНФОРМАЦИОИНОГО ПОЛИМОРФИЗМА . ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ К РИФАМПИЦИНУ У I I 3. ХАРАКТЕРИСТИКА СПЕКТРА МУТАЦИЙ, ОБУСЛАВЛИВАЮЩИХ УСТОЙЧИВОСТЬ К РИФАМПИЦИНУ. ВЫЯВЛЕНИЕ ЗНАЧИМОСТИ РЕДКИХ МУТАЦИЙ. ВОЗМОЖНЫЕ ПУТИ РЕШЕНИЯ ПРОБЛЕМЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МУТАЦИЙ В ПЦРПРОДУКТАХ. РАЗРАБОТКА ОПТИМАЛЬНЫХ УСЛОВИЙ ПРОВЕДЕНИЯ ПЦР ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ II ИСПЫТАНИЕ СОЗДАННОЙ ТЕСТСИСТЕМЫ НА КОЛЛЕКЦИОННЫХ ШТАММАХ. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГНЕЗДОВОЙ ПЦР ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСА ПРОСТОГО ГЕРПЕСА ЧЕЛОВЕКА IIIII ТИПА IIV1 IIV2. ЛТФ англ. НЦР англ. Актуальность проблемы. Важнейшим элементом диагностики инфекционных болезней, бактерионосительства, санитарного контроля, экологического мониторинга окружающей среды является детекция инфекционного агента. Среди способов определения возбудителей главенствуют классический микробиологический и иммуноферментный методы. В последнее время в диагностике микрорганизмов применяют выявление специфического фрагмента нуклеотидной последовательности возбудителя, который можно идентифицировать, используя как индикатор его наличия, способность к воспроизведению i vi в присутствии ДНКполимеразы, праймеров и дсзоксирибоиуклеотидов. Этот процесс, подобный процессу естественной репликации хромосом и отличающийся от него исключительно быстрым экспоненциальным накоплением короткого фрагмента ДНК, называется полимеразной цепной реакцией ПЦР 4. По чувствительности, быстроте, простоте и дешевизне ПЦР сопоставима с иммуноферментным анализом пли даже превосходит его. В некоторых, случаях ПЦР оказывается предпочтительным или единственно возможным методом детекции возбудителя. Актуальность представленной диссертационной работы обусловлена необходимостью повышения достоверности, чувствительности и скорости выявления возбудителей. Вариант метода ПЦР, называемый или гнездовой ПЦР, нацелен на исключение ошибочных рсультатов и обладает повышенной чувствительностью. Суть гнездовой ПЦР заключается в проведениии двух последовательных реакций, при которых исходным материалом для второй реакции является продукт ампликон первой 6. Так обеспечивается двойной контроль результата анализа, практически исключающий вероятность ошибки. Кроме этого, гнездовая ПЦР обладает дополнительным преимуществом. Зконца праймера 4. Создание новых методов тестирования, на наш взгляд, прежде всего необходимо для возбудителей пяти особо опасных или социально значимых инфекций чумы, холеры, гепатита А, простого герпеса 1 и II типа VI и VII, а также устойчивого к рифампнцнну i i. Например, выявление с помощью гнездовой ПЦР возбудителя чумы в тестируемом материале позволит своевременно применить экстренные меры профилактики и терапии . Трудоемкость, длительность и относительно высокий риск ошибок при использовании на практике традиционного двухэтапного подхода, применяемого для обнаружения вирулентных штаммов Vii у больных, вибрионоентелей, в объектах окружающей среды также делает гнездовую ПЦР предпочтительным методом анализа. В данном случае ПЦР позволяет идентифицировать возбудителя непосредственно в клиническом материале, прошедшем бактерицидную обработку, минуя стадию подращивания и клонирования этого опасного микроорганизма. Нужно отметить, что для i i характерен медленный рост на питательных средах. Это не позволяет своевременно выявить у пациентов лекарственноустойчивыс штаммы, в частности, штаммы, устойчивые к рифампицину одному из ведущих противотуберкулезных препаратов 3. Возможной альтернативой остается определение мутаций, вызывающих устойчивость к лекарству. Для определения таких мутаций необходим быстрый, недорогой и нетрудоемкий метод. В этом случае также может быть применена гнездовая ПЦР с использованием аллельспецифических праймеров, перекрывающих несколько мутантных сайтов, дополненная методом конформационного полиморфизма ДНК i i i, . Герпетическая инфекция человека болезнь, дающая серьезные осложнения.