Конструирование рекомбинантного штамма Escherichia coli, продуцирующего адгезин К88 и В-субъединицу холерного токсина

• Автор: Войтенко, Андрей Сергеевич
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 132 с.

1.1.1. Характеристика кодибактериозов.

1.1.2. Основные этапы инфекционного процесса при колидиареях

1.1.3. Факторы патогенности антеротоксигекных штаммов кишечной палочки ЕТЕС

1.1.4. Иммуногенный потенциал протектизных антигенов знтеротоксигенных штаммов кишечной палочки

1.2. Средства специфической профилактики диарейных за

болеваний, вызываемых энтеротоксигенными штаммами

кишечной палочки

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды

2.2. Питательные среды и реактивы.

2.3. Методы.
2.3.1. Коньюгационные скрещивания.
2.3.2. Изучение стабильности наследования плазмид в клетках кишечной палочки методом популяционного анализа.
2.3.3. Изучение плазмидного состава получении транскокыэгантов .i.
2.3.4. Реакция маннозорезистенткой гемаггдютинации
МРГА
2.3.5. Определение продукции Всубьединицы холерного токсина.
2.3.6. Определение безвредности штаммов кишечной палочки нэ модели лабораторкых животных
2.3.7. Определение колонизирующей способности штаммов кишечной палочки
2.3.8. Изучение антигенных свойств рекомбинантного штамма Е.со МрК ппкап рЕГчСЗ
2.3.3. Получение адсорбированной антисыворотки к ад гевииу каа и Бсубьединице холерного токсина
2.3 ДОТиммуноаналиэ.
2.2 Определение в сыворотке крови иммунизированных животных антител к адгезину К с помощью реакции агглютинации.
2.3 Определение антитоксических антител з сыворотке крови имункизированных кроликов .
ГЛАВА 3. КОНСТРУИРОВАНИЕ ДИШ1АЗШДН0Г0 ШТАША КИШЕЧНОЙ ПАЛОЧКИ М рК гг.г. кап р IЕМЗ, СОДЕРЖАЩЕГО РЕКОЕИНАНТНЬЕ ПЛАЗМИДЫ С КЛОНИРОВАННОЙ ГЕНАМИ АДГЕЗИНА К И ВСУБЬЕДИНИЦЫ ХОЛЕРНОГО ТОКСИНА.
3.1. Коньюгацисняое введение в штамм кишечной палочки
М плазмиды рК.iiкап и изучение стабильнос
ти ее наследования в клстках Е.соИ М.
3.2. Изучение экспрессии плазыидных генов Гае в клетка созданного штамма кишечной наточки МрКЗЗпиткап р1ЕМЗ и определение оптимальных условий для биосинтеза клетками адгееика К.
3.3. Коньюгационкое введение в штамм кишечной палочки МрКii плазмиды рЕМЗ и изучение стабильности ее наследования в клетках .i
8 iiрЕМЗ.
ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ И СТАБИЛЬНОСТИ НАСЛЕДОВАНИЯ ЕЕЕДЕННЫХ ГЕНОВ ПРОТЕКТИЕНЫК АНТИГЕНОВ АДГЕЗИНА К И БСУБЪЕДИНИЦЫ ХОЛЕРНОГО ТОКСИНА В ПГГАММЕ .i iiI
4.1. Определение экспрессии генов Всубьедикицы холерного токсина в клетках штамма .i МрКii рЕМЗ.
4.2. Определение экспрессии генов адгезина К в клетках .i МрК i рЕКСЗ.
4.3. Стабильность наследования плазмид рКii и рЕМЗ штаммом .i М в условиях i vi и
i viv.
ГЛАВА 5 ИЗУЧЕНИЕ БЕЗОПАСНОСТИ, КОЛОНИЗИРУЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ И АНТИГЕННЫХ СВОЙСТВ СКОНСТРУИРОВАННОГО ДИПЛАЗЫИДНОГО .i рК ii рЕМЗ
5.1. Изучение безвредности штамма .i МрКi
iр1ЕМЗ
5.2. Определение колонизирующей способности штамма .i iiI3.
5.3. Изучение антигенных свойств штамма .i iiI3.
ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Убитые вакцины остаются недостаточно аффективными, поскольку не могут обеспечить продолжительную и напряженную специфическую защиту, а живые вакцины имеют остаточную реактогенность. Кроме того, вакцины, разработанные в зарубежных лабораториях, являются недоступными для России. Анализ вышеизложенных данных позволяет считать, что исследования, связанные с созданием рекомбинантных штаммов, продуцирующих основные протективные антигены, являются весьма актуальными, поскольку направлены на решение проблемы вакцинопрсфилактики колибактериоза. ЦЕЛЬ РАБОТЫ на основе авирулентного штамма с. Сконструировать днплазмидный шташ . М, содержащий гены, кодирующие биосинтез пилей адгезии К фактора колонизации тонкого кишечника свиней к Всубьединицы холерного токсина, являющихся лротектиЕными антигенами, формирующими антиадгезиЕный и антитоксический иммунитет. Изучить стабильность наследования введенных гомологичных гены пилей адгезии 8 и гетерологичных гены Всубьединицы холерного токсина генов в клетках штамма . Определить эффективность экспрессии генов, контролирующих продукций адгезкна 8 и Всубьединицы холерного токсина, в клетках нового хозяина . Провести сравнительный анализ колонизирующей способности сконструированного диплаэмидного штамма . М ii рЕМЗ и исходного штамма . Определить безвредность и изучить антигенные свойства рекомбкнантного штамма . М рКiрГЕМЗ в условиях I viv. НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. В результате проведенных экспериментов впервые в России на азирулектного штамма . М сконструирован рекомби
нантный диплавмидный штамм . К и Всубьединицы холерного токсина. Впервые показано, что в клетках штамма . М могут стабильно наследоваться и эффективно экспрессироваться гены фактора колонизации свиней К и Всубьединицы холерного токсина, локализованные на двух рекомСкнантных плазмидах рКii и р1ЕМЗ, соответственно. Установлено, что оптимальными условиями для экспрессии адгезина К в клетках штамма . М в условиях i vi являются культивирование ка агаре в течении часов при С. В этих условиях адгезивная активность клеток . М с плазмидой рК ii возрастает в раз по сравнению с исходными штаммами. На модели лабораторных животных крольчатасосунки впервые проведено сравнительное изучение колонизирующей способности сконструированного рекомбинантного штамма . М ii I3. Установлено, что созданный штамм в 1XX раз активнее заселяет тонкий кишечник крольчатсосунков по сравнению с исходным штаммом . М. Получены новые экспериментальные данные о том, что введение штамма . ЕМЗ вызывает образование у привитых животных антител к адгезину К и Всубъединице холерного токсина. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. В Государственной коллекции патогенных бактерий Микроб депонирован сконструированный рекомбинантный диллаэмидный штамм . Кiiр1ЕМЗ, а также мокоплаэмидный шталм . Кii. Определена высокая актигекность
иплазмидного штамма . МрКiiкапрЕМЗ для лабораторных животных, что указывает на перспективность дальнейших гсоледований его иммунобиологических свойств с целью испытания казанного штамма в качестве потенциальной живой вакцины против солкбактериоза свиней. Теоретически и практически значимые результаты диссертации 2ключены в цикл лекций по биотехнологии для студентов СГАУ им. ЗАЩИТУ. На основе авирулентного штамма . М сконструирован помощью молекулярногенетических методов рекомбинантный дипазмиднш шташ . М рК ii I3, содержащий ены двух основных протективных антигенов адгезина Кав, присутствующего в штамма кишечной палочки, патогенных для овиней, Всубьединицы холерного токсина. Плагмидкые гены, контролирующие биосинтез адгезина Кав Всубьединицы холерного токсина, стабильно наследуются и эффективно экспрессируются в клетках штамма . Присутствие в клетках . М плазмиды рК ii генами, контролирууэщими продукции адгезина Кав, сбеспечивает заметное повышение адгезивной способности созданного диплазмидзого штамма по сравнению с исходным штаммом . Сконструированный рекомбинантный штамм . М рК ii рОЛЗ по результатам лабораторных испытаний звляется безвредным и обладает антигенными свойствами.