Конструирование тест-системы для выявления возбудителя холеры методом полимеразной цепной реакции

• Автор: Давыдова, Наталия Александровна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 159 с.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Лабораторная диагностика холеры.

1.1.1. Традиционные методы выявления У. сИо1егае.

1.1.2. Использование молекулярногенетических подходов

для шшикацин и идентификации холерных вибрионов

1.2. Пути совершенствования генной диагностики

инфекционных болезней

1.2.1. Способы повышения эффективности реакции

амплификации ДНК

1.2.2. Конкурирующая Г1ЦР
1.2.3. Магаоиммуносепараццоцный ПЦРиалнз.
.г
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Объекты исследования.
2.1.1. Бактериальные штаммы.
2.1.2. Питательные среды
2.2. Культивирование бактерий.
2.3. Отбор и подготовка проб.
2.3.1. Приготовление бактериальных взвесей
2.3.2. Пробы испражнений, рвотных масс
2.3.3. Пробы воды открытых водоемов и смывов с поверхностей
2.4. Выделение ДНК.
2.4.2. Выделение ДНК методом лизиса гуанндннтиоцианатом
с нуклеоеорбцией на силикагеле
2.4.2. Одногтробирочный способ подготовки биологического
материала для ПЦРанализа
2.5. Определение концентрации ДНК.
2.6. Магнонммуносорбционная подготовка проб для ПЦР.
2.7. Полимеразная цепная реакция.
2.8. Статистическая обработка полученных данных
Глава 3. Создание ПЦРтестсистемы для индикации н идентификации
токсигениых штаммов V сИокгае З
3.1. Оптимизация параметров полимеразной цепной реакции
с праймерами на основе с1хА гена V. сИокгае
3.1.1. Выбор олигонуклеотндных праймеров и ДНКматриц
3.1.2. Разработка оптимальных условий ПЦР.
3.2. Разработка схемы подготовки проб для ПЦР.
3.3. Характеристика тестсистемы для выявления
V. сИокгае хА1 методом полимеразной цепной реакции
Г лава 4. Определение диагностической ценности тестсистемы для
выявления V. сИокгае ДхА методом полимеразной цепной
реакции комиссионные испытания
4.1. Программа комиссионных испытаний. 6
4.1.1. Подготовка проб и постановка ПЦР.
. Результаты испытаний
4.2.1. Исследование чистых культур
4.2.2. Исследование биологического материала и объектов внешней среды, искусственно инфицированных
V. сИокгае хА1
4.2.3. Исследование смывов с поверхностей, искусственно инфицированных V. сИокгае ЯхА и V. сИокгае ссхА,
с помощью ПЦР и люминесцентной микроскопии
4.2.4. Специфичность ПЦРтсстснстсмы.
4.2.5. Воспроизводимость результатов
4.3. Оценка ПЦРтестсисгемы для выявления V. сИокгае схА
по результатам комиссионных испытаний.
Глава 5. Применение ПЦРтестсисгемы для детекции и идентификации
токсигснных штаммов V сИокгае
5.1. Идентификация токсигешшх холерных вибрионов .
5.2. ПЦРмониторинг поверхностных водоемов на наличие
V сИокгае схА
Г лава 6. Пути совершенствования ПЦРтестсистсмы для выявления
V. сИокгае схА.
6.1. Разработка конкурирующей ПЦР для детекции
V сИокгае схА
6.2. Выявление V. сИокгае сА в пробах волы открытых
водоемов с помощью магноиммуносепарационного ПЦРанализа
6.3. Мультиплексная ПЦР для одновременного обнаружения
и бнотипирования токсигенных штаммов холерных вибрионов
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ


Показана возможность выявления с помощью ПЦР токсигенных штаммов V. Иоегае в биологическом материале испражнения, рвотные массы и объектах внешней среды вода открытых водоемов, смывы с поверхностей. Разработаны параметры мультиплексной ПЦР для одновременного обнаружения н биотнпирования токсигенных штаммов холерных вибрионов на основе различий в структуре ДНК Юр А гена. Сконструирован внутренний контроль и определены параметры конкурирующей ПЦР с внутренним контролем ПЦРтестсистемы для выявления V. Иоегае сгхА. Показана возможность применения магноиммуносорбентов на этапе подготовки проб при исследоваши больших объемов воды открытых водоемов с помощью разработанной ПЦРтестсистемы. Продемонстрирована эффективность использования ПЦРанализа при исследовании поверхностных водоемов на наличие холерных вибрионов, идентификации культур V. По результатам работы разработана нормативнотехническая документация фармакопейная статья предприятия, фармакопейная статья, экспериментальнопроизводственный регламент, инструкция по применению на тестсистему для выявления V. методом полимеразной цепной реакции. Проведены Государственные приемочные испытания по разработанной и утвержденной комитетом МИБП программе протокол 6 от г. Результаты Госиспытаний одобрены на ученом совете ГИСК им. Л.А. Тарасевнча протокол от г. Получено разрешение комитета МИБП на внедрение Тестсистемы для выявления Vii x методом полимеразной цепной реакции в практику здравоохранения протокол от г. Составлен акт по внедрению тестсистемы для выявления V. методом ПЦР утвержден директором ГИСК им. Л.А. Тарасевнча от г. Разработанная ПЦРтестснстема для выявления V. характеризуется чувствительностью м. Генетический анализ, основанный на мультиплексной ПЦР с тремя парами праймеров на x и гены, дает возможность одновременного выявления и биотипирования токсигенных штаммов V. Применение магноиммуносорбентов на этапе подготовки проб дает возможность эффективно исследовать с помошыо разработанной ПЦРтестсистемы пробы воды большого объема, содержащие незначительное количество клеток возбудителя холеры. Проблемы санитарноэпидемиологической охраны территорий стран СНГ Саратов, Юбилейной научной конференции, посвященной летию ГНЦ прикладной микробиологии Проблемы медицинской и экологической биотехнологии Оболенск. Всероссийской научнопрактической конференции Генодиагностика в современной медицине Москва, 1й Всероссийской научнопрактической конференции Генная диагностика особо опасных инфекций Саратов, итоговой научнопрактической конференции РосНИПЧИ Микроб Саратов, межлабораторных научных конференциях РосНИПЧИ Микроб, , . Основное содержание работы отражено в 8 научных публикациях. Работа состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 9 цитируемых работ. Общий объем диссертации 9 страниц. Текст иллюстрирован таблицами и 3 рисунками. Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1 Л. Во всем мире эпидемиологическая ситуация по холере до сих пор остается нестабильной. По данным ВОЗ за период гг. Большинство случаев отмечено на Африканском континенте . Северную н Южную Америку. Азию и не более 0. Европу. Крупные вспышки холеры были в Мозамбике гг. Уганде г. Кении гг. Демократичсской республики Конго г. Перу , гг. Танзании гг. Бразилии г. Мексике г. В Европе вспышки холеры зарегистрированы в г. Молдове 0 случаев заболевания 5 летальных, Украине 5. Румынии 83. Имеют место случаи заболевания холерой в России Дагестан , гг. Приморье г. Москва , , гг. Челябинск г. С учетом реальной угрозы вспышек этой особо опасной инфекции на территории России крайне важным является своевременное выявление возбудителя, его идентификация и проведение соответствующих противоэпидемических мероприятий. Традиционные методы выявления V. Лабораторные диагностические исследования проводятся с целью выявления больных холерой и вибрионосителей.