Роль полиаминов в адаптации Escherichia coli к супероксидному стрессу

• Автор: Федотова, Марина Валентиновна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Пермь
• Количество страниц: 135 с. : ил.

ГЛАВА 1. Обзор литературы

1 Л. Механизмы образования активных форм кислорода и их токсическое

действие на основные компоненты клетки

1ЛЛ. Пути образования и характеристика АФК

1Л .2. Повреждающее действие АФК на компоненты клетки

1.2. Механизмы адаптивного ответа микроорганизмов на окислительный стресс

1.2.1. Общие регуляторные механизмы адаптации микроорганизмов к стрессовым условиям

1.2.2. Регулоны защиты микроорганизмов от действия окислительного стресса

1.2.3. Механизмы защиты микроорганизмов от действия АФК

1.3. Полиамины и их физиологическая роль

1.3.1. Пути биосинтеза полиаминов

1.3.2. Влияние полиаминов на процессы жизнедеятельности клетки...
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования
2.1. Объекты исследования и условия культивирования
2.2. Определение активности ß-галактозидазы
2.3. Выделение плазмидной ДНК из клеток Escherichia coli
2.4. Трансформация Escherichia coli плазмидной ДНК
2.5. Определение степени суперспирализации ДНК
2.6. Определение содержания полиаминов в клетках
2.7. Определение активности ферментов синтеза полиаминов
2.8. Определение содержания свободных радикалов кислорода в клетках E. coli
2.9. Определение активности глюкозо-6 фосфат дегидрогеназы
2.10. Определение активности фумаразы
2.11. Определение содержания белка
2.12. Определение антиоксидантных свойств полиаминов in vitro
2.13. Определение частоты мутаций
2.14. Подсчет числа живых клеток
2.15. Статистическая обработка данных
РЕЗУЛЬТАТЫ
ГЛАВА 3. Полиамины как регуляторы количества свободных радикалов кислорода в клетках Escherichia coli
3.1. Влияние супероксидного стресса на активность ключевых ферментов синтеза полиаминов
3.2. Антиоксидантные свойства полиаминов in vitro
3.3. Антиоксидантные функции полиаминов in vivo

ГЛАВА 4. Роль полиаминов в регуляции экспрессии генов soxRS регулона
Escherichia coli
4Л. Влияние полиаминов на экспрессию гена soxS в условиях супероксидного стресса
4.2. Влияние пониженного содержания полиаминов в клетке на уровень экспрессии soxS в условиях супероксидного стресса
4.3. Функции полиаминов как положительных транскрипционных модулятров экспрессии генов-мишеней SoxS
ГЛАВА 5. Роль полиаминов как топологических модуляторов ДНК в регуляции уровня экспрессии генов soxRS регулона
5.1. Влияние путресцина на топологию ДНК в условиях супероксидного стресса
5.2. Роль путресцина как топологического модулятора в регуляции генной экспрессии
5.3. Влияние путресцина на частоту мутаций при супероксидном стрессе
ГЛАВА 6. Влияние полиаминов на активность адаптивных ферментов в
клетках Escherichia coli
ГЛАВА 7. Обсуждение результатов
7.1. Полиамины как регуляторы количества свободных радикалов
кислорода в клетках Escherichia coli
7.2 Роль полиаминов в регуляции экспрессии генов soxRS регулона Escherichia coli
7.3. Роль полиаминов как топологических модуляторов ДНК в регуляции уровня экспрессии генов soxRS регулона
7.4. Влияние полиаминов на активность адаптивных ферментов в клетках Escherichia coli
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА

Актуальность проблемы. В течение последнего десятилетие проблема окислительного стресса привлекает все большее внимание как со стороны исследователей в области фундаментальных биологических наук, так и со стороны специалистов практической медицины. Многочисленные исследования свидетельствуют о том, что окислительный стресс является непосредственной причиной возникновения различных болезней человека, в том числе злокачественных новообразований, а также процессов старения организма (Ames et al., 1993). Общность основных механизмов защиты клеток про- и эукариот от окислительного стресса делает актуальным использование микроорганизмов в качестве модели для изучения повреждающего эффекта активных форм кислорода (АФК) на клетку, а также защитных механизмов клетки от этих повреждений (Sigler et al., 1999). В то же время, изучение специфичности адаптивных реакций прокариотических клеток к действию окислительного стресса может способствовать решению проблемы лечения бактериальных инфекций (Островский Д.Н., 1997), поскольку продукция АФК фагоцитами является важным защитным механизмом, лежащим в основе неспецифического иммунитета (Storz, Imlay, 1999). Кроме того, механизм действия некоторых антибиотиков основан на индукции окислительного стресса (Goswami et al, 2006).
В настоящее время интенсивные исследования в области микробиологии и молекулярной биологии обеспечили значительный прогресс в изучении * генов и белков, участвующих в адаптации микроорганизмов к окислительному стрессу (a Demple, 1999). В то же время малоизученным остается вопрос о роли метаболических факторов, которые, как известно, принимают активное участие в адаптивных реакциях клеток на стресс, обеспечивая наиболее адекватное и экономичное приспособление клетки к условиям среды (HengeAronis étal, 1996). Среди таких факторов особый интерес представляют биогенные полиамины, поликатионная природа которых обусловливает возможность их взаимодействия с отрицательно заряженными группами

После каждого разделения пластины высушивали в токе холодного воздуха в течение 5 минут. Полиамины выявляли по сине-зеленому свечению в УФ-лучах, используя монохроматор КФ-4. На каждую пластину наносили стандартные растворы полиаминов, проведенные через все этапы обработки. В качестве стандартных препаратов использовали: спермин х 4НС1, спермидин х ЗНС1 (“Calbiochem”, США), кадаверин х 2НС1 (“Serva”, Германия), путресцин х 2HCI (“ICN”, США).
Высушенные хроматограммы фотографировали с помощью цифровой фотокамеры Olimpus в ультрафиолетовом свете, возбуждающем сине-зеленое свечение пятен дансил-полиаминов, величина и яркость которых пропорциональны их концентрации. Результаты фотографирования обрабатывали с апомощыо компьютерной программы Adobe Photoshop 5.0. На основании полученных данных рассчитывали концентрацию полиаминов в пятне, используя показания оптической плотности пятен соответствующих стандартных полиаминов.
2.7. Определение активности ферментов синтеза полиаминов
Для определения активности ферментов полиаминсинтезирующей системы использовался метод, основанный на измерении количества конечного продукта - путресцина или кадаверина, синтезированного in vitro в орнитин- или лизин-декарбоксилазной реакции (Ткаченко, Чудинов, 1990).
Отбираемые из культуры клетки осаждали центрифугированием (10000 g) в течении 5 минут при температуре -4°С и дважды отмывали физраствором в тех же условиях. Выделенную биомассу ресуспендировали в 20 мМ трис-НС1-буфера (pH 8,0) и озвучивали на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2 при частоте 22 кГц в течение 1 минуты 15-секундными циклами с охлаждением на ледяной бане. Разрушенные клетки центрифугировали 20 минут при 16000 g, супернатант использовали для проведения ферментативной реакции.