Конструирование и изучение иммунобиологических свойств рекомбинантных штаммов Escherichia coli и Vibrio cholerae, продуцирующих протективные антигены - В-субъединицу холерного токсина и адгезин CFA/I

• Автор: Кобкова, Ирина Михайловна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 140 с. : 19 ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ПРИНЯТЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Основные нротсктивныс антигены возбудителя холеры.

1.1.1. Протективные антегены Vii серогрунпы.

1.1.2. Протективные антигены V. серогрунпы.

1.2. Протективные антигены кишечной палочки

1.3. Живые холерные вакцины

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.Г

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Бактериальные штаммы
2.2. Пи гательные среды и реактивы.
2.3. Методы
2.3.1. Коныогациониыс скрещивания.
2.3.2. Метод популяционного анализа для изучения стабильности на
следования плазмид в клетках изучаемых штаммов.
2.3.3. Скрининг плазмид по методу , i
2.3.4. Электрофорез белков холерного вибриона в полиакриламидном
2.3.5. Реакция маниозорезистентной гемагглютинации МРГА.
2.3.6. Реакция пассивного иммунного гемолиза РПИГ и иммунофер
ментнмй анализ I.
2.3.7. Электронномикроскопическое исследование.
2.3.8. Определение продукции фосфолипазы и растворимой гемагглютипинпротеазы.
2.3.9. Определение безвредности сконструированных штаммов на модельных лабораторных животных
2.3 Исследование колонизирующей способности созданных диплазмидных штаммов.
2.3 Изучение антигенных свойств диплазмидных штаммов
2.3 Получение адсорбированной антисыворотки к адгезину I и Всубъединнце холерного токсина
2.3 Дотиммуноанализ ДИА
2.3 Развернутая реакция агглютинации в пробирках для определения титра антител к адгезину I в крови иммунизированных животных.
2.3 Иммуноферментный метод IА
2.3 Оценка протективности сконструированного штамма . i КМ8 но снижению количества вирулентных вибрионов, прикрепившихся к кишечному эпителию иммунных кроликов.
2.3 Метод , использованный для определения протсктивпых свойств сконструированных штаммов
ГЛАВА 3. КОНСТРУИРОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ .
8I3I И К 2I3I
3.1. Создание диплазмндного штамма . i М, содержащего рекомбинантные плазмиды с клонированными генами Всубъединицы холерного токсина и адгезина СКАЯ
3.2. Получение авирулентного диплазмндного штамма V. серогруппы, содержащего рекомбинантные плазмиды с клонированными генами Всубъединицы холерного токсина и адгезина 1
ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ СТАБИЛЬНОСТИ НАСЛЕДОВАНИЯ ГЕНОВ ПРОТЕКТИВНЫХ АНТИГЕНОВ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ИХ ЭКСПРЕССИИ В СОЗДАННЫХ ШТАММАХ . I
8I3I И V 2I3I
4.1. Определение стабильности наследования рекомбинантных плазмид в клетках штаммов . i 8I3I и V. 2I3I в условиях i vi и i viv
4.2. Изучение экспрессии введенных генов протективных антигенов
в клетках штаммов Е. i КМ8 и V КМ2.
4.2.1. Определение экспрессии генов Всубъединицы холерного токсина в клетках исследуемых штаммов.
4.2.2. Определение экспрессии генов адгезина I в клетках штаммов . i КМ8 и V. КМ2
4.2.3 Изучение влияния чужеродного гена на экспрессию собственных генов протективных антигенов у К КМ2.
ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ БЕЗВРЕДНОСТИ, КОЛОНИЗИРУЮЩЕЙ СПОСОБНО
СТИ, АНТИГЕННЫХ И ПРОТЕКТИВНЫХ СВОЙСТВ СКОНСТРУИРОВАННЫХ ДИПЛАЗМИДНЫХ ШТАММОВ Е. СОИ КМ8
I3I И V 2I3I
5.1. Изучение безвредности штаммов . i 8 и V. 2
5.2. Определение колонизирующей способности исследуемых диплазмидных штаммов
5.2.1. Определение колонизирующей способности штамма кишечной палочки . i КМ8.
5.2.2. Определение колонизирующей способности штамма холерного вибриона серогруппы V. КМ2
5.3. Определение антигенных свойств сконструированных диплазмидных штаммов . i КМ8 и V. КМ 2
5.3.1. Определение антигенных свойств штамма . i КМ8 по накоплению в сыворотке крови иммунизированных животных антиколонизирующих и антитоксических антител
5.3.2. Определение антигенных свойств штамма V. КМ 2 по накоплению в сыворотке крови иммунизированных животных антиколонизирующих и антитоксических антител
5.4. Определение протективных свойств исследуемых штаммов
5.4.1. Определение протективности штамма . i КМ8 по снижению количества вирулентных вибрионов, прикрепившихся к кишечному эпителию иммунных кроликов
5.4.2. Определение протективных свойств штамма кишечной палочки
. i КМ8 методом I.
5.4.3. Определение протективных свойств сконструированного штамма
V. КМ2 методом I.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ


Экспрессия соответствующих генов в клетках хозяина приводит к развитию иммунного ответа и, как следствие, к защите от инфекции Каригина и др. Безусловно, очевиден мощный потенциал данной технологии для решения задач специфической профилактики, но в этом направлении необходимы дальнейшие исследования. Таким образом, несмотря на попытки многих исследователей в течение более 0 лет создать идеальную холерную вакцину, до сих нор проблема разработки эффективного и безопасною профилактического препарата против холеры остается нерешенной. Отсутствие доступных для нас сведений о сконструированных отечественных живых вакцинных штаммов против холеры, которые были бы не только эффективны, но и безопасны, свидетельствует об актуальности исследований, направленных на получение холерных вакцин нового поколения. Установлено, что в сконструированных штаммах . I3I и V. I2I3 введенные в составе плазмид клонированные гомо и гетерологичные гены x и , определяющие биосинтез Всубъединицы холерного токсина и фактора адгезии 1 основных иротективных антигенов, стабильно наследуются в условиях i vi и i viv. Выявленный уровень биосинтеза Всубъединицы холерного токсина и адгезина I в клетках диплазмидных штаммов кишечной палочки и холерного вибриона указывает на эффективную экспрессию введенных генов. Новые данные получены при исследовании колонизирующей активности штаммов . I3I и V. I2I3I на модели лабораторных животных крольчагасосунки. Установлено, что присутствие в созданных штаммах . КМ 8 и V. КМ 2 плазмиды I обеспечивает повышение их колонизирующей активности, соответственно, в раз и раз, по сравнению с исходными штаммами . М и V. Установлено, что сконструированные штаммы обладают выраженными иммуногенными свойствами, вызывая у иммунизированных животных образование высоких титрах антитоксических и антиколонизирующих антител. Доказана iтективность сконструированных штаммов, которая выразилась в эффективной защите иммунизированных животных от заражения их в высоких дозах К9 м. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. По результатам работы составлены методические рекомендации Конструирование потенциально вакцинных штаммов против диарейных заболеваний, которые одобрены Ученым Советом протокол 7 от декабря г. РосНИГЧИ Микроб. В Государственной коллекции патогенных бактерий Микроб депонированы два штамма Е. М и два штамма V с разным набором генов протсктивных антигенов Всубъединицы холерного токсина и адгезина I. Указанные штаммы могут быть использованы для решения прикладных и фундаментальных задач. Получены три патента на изобретения патент 9 Штамм бактерий ii i КМ 8 продуцент протсктивных антигенов, используемых для иммунопрофилактики колибактериоза и холеры от патент 5 Штамм бактерий ii i КМ 7продуцент Всубъединицы холерного токсина от , который внесен в базу данных перспективных Российских разработок РОСПАТЕНТа патент 5 Штамм бактерий Vii КМ 8 основа для конструирования живых вакцин против диарейных заболеваний, вызываемых штаммами Vii от . Па основе авирулентных штаммов кишечной палочки Е. V 0 сконструированы диплазмидные штаммы Е. КМ 8 и V. КМ 2. I энтеротоксигенных кишечных палочек. Клонированные в составе плазмид гены x и , кодирующие биосинтез субъединицы холерного токсина и адгезина I, стабильно наследуются и эффективно экспрессируются в клетках созданных авирулентных штаммов . КМ 8 и V. КМ 2. Присутствие в клетках сконструированных штаммов . КМ 8 и V. КМ 2 плазмиды I с геном , контролирующим продукцию адгезина I, обеспечивает значительное повышение их адгезивной способности по сравнению с исходными штаммами . К 0. Сконструированные рекомбинантные штаммы . КМ 8 и V. КМ 2 на основании клиникоморфологических показателей являются безвредными для лабораторных животных, обладают высокой колонизирующей способностью и выраженными иммуиогенными свойствами. Исследуемые штаммы . КМ8 и V. КМ 2 имеют высокую протективную активность. Они эффективно защищают модельных лабораторных животных от последующего заражения их вирулентными штаммами холерного вибриона и серогрупп. АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.