Конструирование рекомбинантных аденовирусов птиц CELO, экспрессирующих протективные антигены вирусов болезни Марека и гриппа птиц

• Автор: Карпов, Андрей Павлович
• Шифр специальности: 03.00.07, 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 124 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Генноинженерные векторы, используемые при создании кандидатных вакцин.

1.1.1 Типы генноинженерных векторов

1.1.2. Вирусные векторы, используемые для создания кандидатных генноинженерных вакцин

1.1.3 Генноинженерные векторы на основе аденовирусов.

1.1.3.1 Структурнофункциональная характеристика аденовирусов человека.

1.1.3.2 Векторы на основе генома аденовируса человека

1.1.3.3 Структурные особенности аденовируса птиц СЕШ.

1.1.3.4 Векторы на основе генома аденовируса птиц СЕШ
1.2 Вакциннопрофилактика инфекций, вызываемых вирусом гриппа птиц и вирусом болезни Марека.
1.2.1. Вакцины, используемые для предупреждения инфекции вируса гриппа птиц.
1.2.2. Вакцины, используемые для предупреждения инфекции ВБМ.ЗЗ
1.2.3 Необходимость использования генноинженерных вакцин при инфекциях вируса гриппа птиц и вируса болезни Марека.
1.2.4. Кандидатные генноинженерные вакцины против вируса гриппа птиц, полученные на основе вирусных векторов
1.2.5. Кандидатные генноинженерные вакцины против ВБМ, полученные на основе вирусных векторов
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1.1 Материалы
2.1.2. Методы
2.2 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.2.1 Клонирование генов гликопротеинов , и из генома ВБМ и гена гемагглютинина из генома вируса гриппа
2.2.1.1 Клонирование генов гликопротеинов , и из генома ВБМ методом ГЩР.
2.2.1.2 Клонирование полноразмерного гена гемагглютинина из генома вируса гриппа типа методом ОТПЦР
2.2.2 Конструирование рекомбинантных аденовирусов на основе генома , несущих гены гликопротеинов , и ВБМ и ген гемагглютинина вируса гриппа птиц
2.2.3 Изучение экспрессии генов гликопротеинов , и ВБМ и гена гемагглютинина вируса гриппа птиц рекомбинантными аденовирусами в экспериментах i vi
2.2.3.1 Анализ экспрессии генов гликопротеинов ВБМ в культуре клеток, заражнных рекомбинантными аденовирусами, методом ОТПЦР
2.2.3.2 Определение экспрессии гликопротеина ВБМ вирусом методом иммуноблоттинга в культуре заражнных клеток.
2.2.3.3 Определение экспрессии гемагглютинина вируса гриппа птиц методом иммуноблоттинга в культуре клеток, зараженных рекомбинантным аденовирусом ЫА
2.2.3.4. Определение экспрессии гена гемагглютинина НА вируса гриппа птиц штамма Н5 методом ИФА
2.2.4 Генетическая иммунизация рекомбинантными аденовирусами
2.2.4.1 Определение иммуногенности рекомбинантного гликопротеина ВБМ, экспрессируемого на цыплятах.
2.2.4.2 Определение иммуногенности рекомбинантного гемагглютинина, экспрессируемого НА методом РТГА.
2.2.5 Определение протективности рекомбинантного гемагглютинина,
экспрессируемого СЕШНА, на лабораторных животных.
2.2.5.1 Определение оптимального способа имхмунизации мышей линии ВАБВс рекомбинантным СЕШНА
2.2.5.2 Анализ протективности НАспецифического иммунного ответа мышей, иммунизированных рекомбинантным аденовирусом СЕШНА, с
последующим заражением летальной дозой вируса гриппа птиц Н5Ы2
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Получение рекомбинантных аденовирусов птиц , несущих ген гемагглютинина НА5 и гены гликопротеинов , и ВБМ под контролем Vпромотора в сайте делеции несущественной области генома вектора, методом гомологичной рекомбинации в . Изучение экспрессии целевых генов в составе рекомбинантных вирусов на основе аденовируса в условиях i vi. Изучение индукции специфического иммунитета в ответ на экспрессию гликопротеинов вируса болезни Марека и гриппа птиц в организме лабораторных животных при генетической иммунизации рекомбинантными вирусами . Определение протективности гемагглютинииспецифического иммунного ответа у мышей, иммунизированных рекомбинантным аденовирусом , экспрессирующим НА5 вируса гриппа птиц штамма . Научная новизна. Разработана эффективная технология получения рекомбинантных аденовирусов на основе , основанная на гомологичной рекомбинации в . Получен набор рекомбинантных аденовирусов НА, несущий ген гемагглютинина вируса гриппа птиц штамма , и , , , несущие гены соответствующих гликопротеинов ВБМ штамма 1. Показана экспрессия мРНК генов гликопротеинов , и ВБМ на культуре клеток, заражнных рекомбинантным аденовирусом птиц , несущим соответствующий целевой ген. Подтверждена идентичность антигенных свойств рекомбинантного гликопротеина , экспрессируемого вирусом , в сравнении с природным гликопротеином ВБМ штамма 1. Показана иммуногенность гликопротеина ВБМ, экспрессируемого рекомбинантным аденовирусом , на естественно восприимчивой для вируса болезни Марека модели птиц. Подтверждена идентичность антигенных свойств рекомбинантного гемагглютинина, экспрессируемого вирусом , в сравнении с природным гемагглютинином вируса гриппа птиц штамма . Определено содержание рекомбинантного гемагглютинина НА5 в культуре клеток, заражнных рекомбинантным аденовирусом . Определн оптимальный способ иммунизации лабораторных животных рекомбинантным аденовирусом , при котором экспрессируемый гемагглютинин проявляет наибольшую защиту против вирулентного вируса гриппа. Впервые показана защита мышей, иммунизированных рекомбинантным аденовирусом , экспрессирующим гемагглютинин НА5, в условиях экспериментального заражения мышей летальной дозой вируса гриппа птиц 5. Практическая значимость. Ген гемагглютинина вируса гриппа птиц штамма и гены гликопротеинов , и вируса болезни Марека штамма 1, клонированные в плазмидном векторе , коллекция рекомбинантных аденовирусов , , и , хранятся в музее лаборатории молекулярной биотехнологии ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН ГУ НИИ ЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН. ВБМ модели птиц. Рекомбинантный аденовирус СЕЬОНА, экспрессирующий гемагглютинин НА вируса гриппа птиц штамма Н5Ы2, используется в эксперименте по определению протективности иммунизации на пермиссивной для вируса гриппа модели птиц. Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на IV международной научной конференции студентов и молодых учных Живые системы и биологическая безопасность населения Москва, , международной юбилейной научнопрактической конференции, посвящнной 0летию Курской биофабрики и агробиологической промышленности России Курск, , V международной научной конференции студентов и молодых учных Живые системы и биологическая безопасность населения Москва, , IV Московском международном конгрессе Экспобиохимтехнологии Москва, , VI международной научной конференции студентов и молодых учных Живые системы и биологическая безопасность населения Москва, , расширенном заседании кафедры биологии, вирусологии и генной инженерии ГОУ ВПО МГУПБ 1 ноября года, заседании отдела генетики и молекулярной биологии бактерий декабря г. ГУ НИИ ЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе 2 в журналах, рекомендованных ВАК, и 5 статей в сборниках международных конференций. Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 4 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы и список используемой литературы 4 источников, из которых отечественных и 9 иностранных. Работа содержит 4 таблицы и рисунков.