Конструирование и внедрение в практику генодиагностической тест-системы для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы

• Автор: Тучков, Игорь Витальевич
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 145 с. : 15 ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Современное состояние лабораторной диагностики сибирской язвы

1Л. Генетическая организация В. апгасхБ

1.2. Лабораторная диагностика сибирской язвы

1.2 Л. Характеристика классических методов диагностики

1.2.2. Молекулярногенетические методы в диагностике возбудителя сибирской язвы

1.2.3. Условия проведения ГИДР и способы подготовки проб исследуемого материала

Глава 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Бактериальные штаммы
2.2. Реактивы и питательные среды
2.3. Экспериментальные животные
2.4. Культивирование микроорганизмов
2.5. Подготовка проб из биологического материала к исследованию в ПЦР
2.5.1.Подготовка проб крови
2.5.2. Подготовка проб из органов лабораторных животных
2.5.3. Подготовка проб из объектов окружающей среды
2.6. Определение концентрации ДНК в пробах исследуемого материала
2.7. Определение размеров фрагментов ДНК
2.8. ПЦРанализ
2.8.1. Синтез олигонуклсотидных праймеров
2.8.2. Выбор праймеров
2.8.3. Постановка полимеразной цепной реакции
2.8.4. Гельэлектрофорез Глава 3. СОЗДАНИЕ И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ПЦР ТЕСТ
СИСТЕМЫ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ВОЗБУДИТЕЛЯ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ
3.1. Конструирование и изучение штаммов сибиреязвенного микроба с различным плазмидным профилем
3.2. Выбор олигонуклеотидных праймеров и ДНК матрицы
на основе анализа генома
3.3. Разработка оптимальных условий ПЦР
3.4. Разработка способов обеззараживания материала, содержащего спорообразующую культуру В. агйкгаск и схемы подготовки проб для ПЦР
3.4.1. Отработка условий обеззараживания материала, содержащего возбудитель сибирской язвы
3.4.2. Разработка схемы подготовки проб для ПЦР
3.5. Характеристика тестсистемы для выявления
В. i X методом полимеразной цепной реакции
3.6. Разработка мультиплексной ПЦР для детекции
В. i
Глава 4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЦЕННОСТИ
ТЕСТСИСТЕМЫ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК I I X МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕННОЙ РЕАКЦИИ
4.1. Программа комиссионных испытаний
4.1.1.одготовка проб и постановка ПЦР
4.1.2. Исследование чистых культур микроорганизмов
4.1.3. Исследование биологического материала, искусственно инфицированного В. i X
4.1.4. Исследование объектов окружающей среды, искусственно инфицированных В. i рХОГ
4.1.5. Специфичность ЦР тестсистемы
4.1.6. Воспроизводимость результатов
4.2. Оценка ПЦР тестсистемы для выявления ДНК
В. i X но результатам комиссионных
испытаний
Г лава 5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ РАЗРАБОТАННОЙ
ТЕСТ СИСТЕМЫ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК I I РХ МЕТОДОМ ПЦР В ОЧАГЕ
СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ
5.1. Эпидемиологическая обстановка по сибирской язве в Республике Мордовия и результаты оперативного эпидемического анализа
5.2. Лабораторное исследование биологического материала
и объектов окружающей среды в очаге сибирской язвы
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ
I i Ii
додсиилсульфат натрия
V вариабильность числа тандемных повторов
бп бесплазмидный
БСА бычий сывороточный альбумин
ГИСК Государственный институт стандартизации и контроля
медицинских биологических препаратов ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
ДИТФ дезоксинуклеоз идфосфат
ИМС иммунная магносорбция
ИС иммуносорбент
ИФА иммуноферментный анализ
КРС крупный рогатый скот
ЛФ легальный фактор
м.к. микробная клетка
МИБП медицинские иммунобиологические препараты
н.м. нанометр
ОФ отечный фактор
п.н. пара нуклеотидов
ПА протективный антиген
ПЦР полимеразная цепная реакция
РА реакция агглютинации
РНГА реакция непрямой пассивной гемагглютинации
т.п.н. тысяч пар нуклеотидов
ТАЕ трисi ютатЭ ДТА буфер
Трис гидроксиметил аминометан
ЭДГА этилендиаминтетроуксусной кислоты назревая соль
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Сконструированная тестсистема для выявления ДНК i i рХОГ методом ПЦР характеризуется чувствительностью м. ДИК возбудителя сибирской язвы в биологическом материале и объектах окружающей среды. Способ подготовки проб, включающий этап инактивации спорообразующей культуры и последующую экстракцию ДНК с использованием в качестве лизирующего агента гуанидинтиоцианата, обеспечивает обеззараживание исследуемого материала и не влияет на чувствительность ПЦРанализа. Метод ПЦР эффективен для лабораторной диагностики сибирской язвы у людей и сельскохозяйственных животных, индикации В. В. ап1кгас . Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Российских научных конференциях Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций Волгоград, и Актуальные вопросы дезинфекции, стерилизации, дезинсекции, дератизации Москва, Межгосударственной научнопрактической конференции Актуальные вопросы чумы и других инфекционных заболеваний, посвященной 0летию открытия возбудителя чумы Ставрополь, научнопрактической конференции, посвященной 0летию образования противочумной службы России Саратов, Юбилейной научной конференции Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария, посвящнной летию НИИ микробиологии Минобороны России Киров, Международной научнопрактической конференции Проблемы санитарноэпидемиологической охраны территории СИР Саратов, на 3ей Всероссийской научнопрактической конференции Генодиагностика в современной медицине Москва, Гой Всероссийской научнопрактической конференции Генная диагностика особо опасных инфекций Саратов, итоговых научных конференциях РосНИПЧИ Микроб 4ой Всероссийской научнопрактической конференции Генодиагностика инфекционных заболеваний Москва, 4ой Межгосударственной научнопрактической конференции Современные технологии в диагностике особо опасных болезнейСаратов, . Публикации. Основное содержание работы отражено в научных публикациях. Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, обзора литсратуры, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Общий объем диссертации 0 страниц. Текст иллюстрирован таблицами и рисунками. ГЛАВА . Генетическая организация i, i. Сибиреязвенный микроб В. Берджи палочки, образующие эндоспоры. В настоящее время род i подразделяется на две группы, в которые входят несколько видов. Если для видов первой iii установлены 1раницы, то существование видов второй группы не получило общего признания и большинство представителей входят в i i i вид с неясным систематическим положением i . Возбудитель сибирской язвы В. В. i виды такие, как i, , i, ii, i, ii, i, i и другие. Результаты многолокуспого электрофоретического анализа ферментов и сравнительный ДНК секвенс позволяют предположить, что они относятся к одному виду . Вес они имеют ряд сходных морфологических и культуральных свойств и происхождение от общего предшественника. Дифференциальная диагностика их очень сложна. Основные функциональные различия между В. В. i и i iii связаны с наличием плазмид, варьирующих по числу и размеру . Вирулентные штаммы В. X и рХ i . Плазмид с электрофоретической подвижностью характерной для X и рХ у близкородственных бацилл не обнаружено Ахмедзянов Ю. А. с соавт. Проведен полный ДНК ссквснс плазмид X и рХ2. Содержание ГЦ пар этих плазмид сходно с таковыми на хромосоме. Плазмида X характеризуется размером 1, 4 т. В. i и содержит 3 открытых рамок считывания , что составляет только 0,7 т. ДНК X i . Т. . Только для 9 генов X определена их функция. X располагаются внутри ,8 участка и организованы в так называемый остров патогенности, который фланкирован инвертированными I элементами. Внутри острова патогенности локализованы структурные гены , и суа, кодирующие синтез протективного антигена ПА, летального фактора ЛФ и отечного фактора ОФ соответственно, гены клонированы и секвенированы i Р. Vi М. Отечный фактор ОФ играет важную роль на ранних этапах инфекции и его действие на эукариотические клетки проявляется в неконтролируемом увеличении от 5 до раз, в зависимости от типа клеток концентрации цАМФ .