Клонирование генов, кодирующих синтез лизоцима Staphylococcus aureus и лизостафина Staphylococcus simulans, их экспрессия в гетерологичных хозяевах

• Автор: Жаданова, Людмила Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 139 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Биологическая характеристика и лизоцимная активность различных видов стафилококков.
2. Основные биологические свойства бактериального лизоцима, отличительные особенности бактериального лизоцима по сравнению с яичным, механизм его антимикробного действия и методы выделения.
Ъ. Биологическая роль лизоцимного фактора у микроорганизмов и практическое использование лизоцима в медицине.

4. Лизоцимная активность грамположительных микроорганизмов.

5. Факторы межмикробного взаимодействия

стафилококков в бактериальном биоценозе.

6. Генетические механизмы . контроля факторов межмикробного взаимодействия

7. Клонирование генов литических ферментов грамположительных бактерий

ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
1. Питательные среды и штаммы бактерий.
2. Микробиологические методы.
2.1. Качественный метод определения лизоцимной
активности у клинических изолятов . , i , В. ii
2.2. Качественный метод определения
лизостафиновой активности i.
2.3. Количественный метод определения лизоцимной активности . , i , В.
ii.
2.4. Определение антагонистической активности
лактобацилл против условнопатогенных бактерий.
3. Молекулярногенетические методы
4. Методы статистического анализа.
Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ
ИССЛЕДОВАНИЙ
1. Коллекция клинических штаммов . и их общая характеристика.
2. Определение спектров лизоцимной активности 8 и лизостафиновой активности i
3. Выбор векторной системы и реципиента для клонирования гена лизоцима . 8 и гена лизостафина . i
4. Проверка штаммов i ii на лизоцимную и лизостафиновую активность, на устойчивость к лизоциму . 8 и лизостафину . i
5. Клонирование гена, кодирующего лизоцим .
в клетках В. ii .
6. Определение наличия вставки фрагмента чужеродной хромосомной ДНК . 8 в рекомбинантных плазмидах ,4 i, методом ПЦР.
7. Клонирование гена лизостафина . i в клетках i ii.
8. Передача и наследование рекомбинантной плазмиды i в клетках В. ii, . i, . .
9. Изучение антагонистической активности
рекомбинантного штамма . I 0 в отношении стафилококков.
Ю.Выявление гена А, контролирующего лизоцимную активность у клинических изолятов . с помощью ПЦР
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
ВВЕДЕНИЕ


Но в настоящее время не существует промышленного производства препаратов, содержащих этот фермент, и работа в данном направлении также является актуальной и перспективной. Особенно эффективным и экономичным было бы создание препарата, содержащего оба вышеуказанных фермента стафилококкового происхождения лизоцим и лизостафин. Е. i, характеризующихся слабым уровнем экспрессии этих генов. Практически отсутствуют данные о клонировании и экспрессии генов стафилококкового лизоцима и лизостафина в других видах бактерий сенной палочке, лактобациллах, поэтому данное направление в генетике стафилококков является актуальным и перспективным. ПЦР для идентификации люоцимактивных штаммов золотистого стафилококка среди клинических изолятов стафилококков. Впервые в качестве реципиента для клонирования генов стафилококкового лизоцима ЛПФ и лизостафина был использован протеазодефицитный мутант В. Показано, что гены, кодирующие синтез лизоцима и лизостафина стафилококков, стабильно наследуются в клетках В. Уровень продукции лизоцима в клетках бацилл в 2,5 раза превышал такавой в исходном штамме . Показана экспрессия гена, кодирующего синтез лизоцима стафилококков в клетках штамма i , не обладающего собственной лизоцимной активностью. Продукция лизоцима в клетках других гибридных штаммов i ТС4 и . ТВ5, характеризующихся различным уровнем собственной лизоцимной активности, превышала исходный уровень продукции фермента. Гйбридные штаммы лактобацилл подавляли рост практически всех клинических изолятов . Практическая значимость работы
В настоящее время активно разрабатываются новые виды пробиотиков, включающие в себя генноинженерные штаммы сенной палочки, дрожжей, лактобацилл, кишечной палочки. Сконструированные нами штаммы лактобацилл и сенной палочки, обладающие повышенным уровнем лизоцимообразования и антагонистической активностью против условнопатогенных бактерий, могут быть рекомендованы в качестве потенциальных штаммов для создания высокоэффективных пробиотиков. Сконструированы штаммы . Разработана тестсистема на основе ПЦР для идентификации и выявления лизоцимактивных штаммов золотистого стафилококка среди клинических изолятов, выделенных от больных, а также из окружающей среды смывы с медицинских инструментов, мебели, белья, медицинской одежды в поликлиниках, больницах и роддомах. По сравнению с более трудоемкими, требующими больших затрат времени и средств традиционными чашечными методами определения лизоцимной . ПЦРтестсистема значительно ускоряет и упрощает процедуру отбора лизоцимактивных штаммов стафилококков. Глава I. Биологическая характеристика и лизоцимная активность различных видов стафилококков. Согласно 9 изданию Определителя бактерий Берджи , стафилококки отнесены к группе грамположительных факультативно анаэробных кокков, где они выделены в отдельный род , объединнный рядом характерных морфологических и физиологических признаков. Это сферические клетки диаметром 0,,5 мкм, грамположительные, неподвижные и не образующие спор. В результате деления стафилококки формируют скопления неправильной формы, напоминающие гроздь винограда. От прочих грамположительных факультативно аэробных кокков, представители рода отличаются совокупностью характеристик, включающих неподвижность, возможность роста при температуре С и С, в сильно щелочной среде рН9,6, а также в присутствии 6,5 и желчи. Стафилококки, как и прочие грамположительные факультативно анаэробные кокки, также существенно отличаются от грамотрицательных бактерий структурой пептидогликана основного структурного полимера их клеточной стенки i, , , наличием в структуре клеточной стенки тейхосвых кислот. Важное дифференциальное значение имеет содержание ГЦпар в структуре ДНК рода , которое составляет . Значительно большие трудности возникают при дифференциации стафилококков от аэробных грамположительных бактерий рода i, так как у них часто совпадает экологическая ниша их обитания кожные покровы и слизистые оболочки человека и животных, а также воздух, вода, почва, пищевые продукты. Возможность использования для межродовой дифференциации лизостафина бактериолитического фактора, продуцируемого .