Особенности биологической активности липополисахарида из фотосинтезирующей бактерии Rhodobacter capsulatus B10

• Автор: Прохоренко, Изабелла Рувимовна
• Шифр специальности: 03.00.07, 14.00.16
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 173 с. : ил

1.1. Генетическая связь между фотосинтезирующими и другими грамотрицательными бактериями.

1.2. Строение клеточной стенки грамотрицательных бактерий

1.3. Строение липолисахаридов.

1.3.1. Состав и строение Оантигена

1.3.2. Структура кора.

1.3.3. Структура и биосинтез липида А.

1.4. Влияние методов выделения на выход и состав ЛПС из грамотрицательных бактерий

1.5. Биологичеакая активность ЛПС

1.5.1. Связь между структурой и биологической активностью ЛПС.

1.5.2. Взаимодействие ЛПС и липида А с фагоцитами.

1.5.3. ЛПСсвязывающий белок плазмы ЬВР.

1.5.4. Рецепторные свойства СО в отношении комплексов ЬВР Л1С
1.6. Пути трансдукции сигнала, запускаемого ЛПС
1.6.1. 4связанные пути трансдукции сигнала
1.6.2. независимые пути трансдукции сигнала
1.7. Медиаторы септического шока.
1.8. Основные подходы к нейтрализации ЛПС и цитокинов при сепсисе.
1.8.1. Подавление влияния ЛПС на клетки.
1.8.2. Подавление влияния на клетки цитокинов, образующихся в ответ на ЛПС.
1.8.3. Природные ингибиторы действия цитокинов.
1.8.4. Антагонисты эндотоксина.
Глава II. Материалы и методы.
II. 1. Получение ЛПС из фотосинтезирующих бактерий
I. 1.1. Культивирование клеток и получение биомассы.
II. 1.2. Получение беспигментной биомассы ацетонового
порошка
II. 1.3. Выделение ЛПС из ацетонового порошка.
II. 1.4. Определение чистоты ЛПС
II.2. Определение качественного и количественного состава ЛПС.
.2.1. Определение качественного состава коммерческих
эндотоксинов и ЛПС методом электрофореза по i.
.2.2. Определение содержания липида А и полисахарида в ЛПС
методом гидролиза.
II. 2.3. Определение содержания КО по модифицированной
методике .
II. 2.4. Определение состава сахаров методом ГЖХ и методом
связывания со специфическими пектинами
7.2.5. Определение состава .жирных кислот методом ГКХ
.2.6. Определение содержания фосфора.
II.3. Выявление антигенных свойств с помощью иммунных методов.
II. 3.1. Получение поликлональных специфических антител
II. 3.2. Оценка специфичности антител методом радиальной иммунодиффузии в агарозном геле
И.4. Методы изучения биологической активности ЛПС и коммерческих эндотоксинов.
.4.1. Выделение нейтрофилов из периферической крови человек
.4.2. Выделение микросомной фракции из печени мышей
II. 4.3. Измерение концентрации свободных ионов Са2 в цитоплазме.
.4.4. Определение содержания цитохрома Р0 в микросомас печени мыши
.4.5. Определение разных видов активностей цитохрома Р0 в
микросомах.
II. 4.6. Определение времени гексеналового спа у мышей
.4.7. Определение артериального давления у крыс
Глава 1. Результаты и их обсуждение.
III.1. Выявление хемотипа и морфологических особенностей исследуемых штаммов бактерий
1.2. Влияние внешних факторов на скорость роста бактерий и их состав
1.3. Влияние метода выделения ЛПС на их состав и структуру
III. 3.1. Влияние способа экстракции пигментов на выход
беспигментной массы.
III. 3.2. Влияние метода выделения на выход ЛПС.
III. 3.3. Сравнение степени гетерогенности препаратов ЛПС,
изолированных различными методами
II1.3.4. Анализ чистоты изолированных ЛПС
II 1.4. Электрофоретическая характеристика ЛПС как
фингерпринт бактерий на уровне штамма.
И 1.5. Сравнительной анализ состава и чистоты ЛПС из
В и ii
1.6. Оценка антигенной активности ЛПС из .
1.7. Изучение биологической активности ЛПС из . и эндотоксинов.
III. 7.1. Защита нейтрофилов человека от действия
эндотоксинов липополисахаридом из
III. 7.2. Действие эндотоксина на систему цитохрома Р
лабораторных мышей линии С5 7В.
III. 7.3. Защитное действие ЛПС из фотосинтезирующих бактерий от летальных эффектов эндотоксинов в острых опытах на мышах.
Заключение
Цитируемая литература
Список сокращений
АПДМ аминопиридиндеметилаза
ЬПМО бензпиренмонооксигеназа
ГЖХ газожидкостная хроматография
ГТФ гуанозин5трифосфат
ДДС додецилсульфат натрия
кДНК комплементарная ДНК
КДО кетодезоксиОлшшооктолузоновая кислота
ЛПС липополисахарид
НАДФН никотинамидадениннуклеотид восстановленный
НК нуклеиновая кислота
ОАг полисахаридный фрагмент ЛПС
ПААТ полиакриламидный гель
ТБС трисбуфер приготовленный на физрастворе
ФСБ фотосинтезирующие бактерии
ФТИР Фурье преобразованная ИКспсктроскопия
ЭДТА этилендиаминотетраацетат
I белок увеличивающий проницаемость мембран
растворимая форма
Са2активируемые каналы плазматической мембраны диацилглицерид
ЫформилЬметионилЬлейцилфенилаланин аминоглюкоза 3 1,3диаминоглюкоза I интерлейкин
II антагонист рецептора для I1 1Р3 лшоинозитол1,4,5трифосфат
человеческие антитела к мышиным антителам
частота сердечных сокращений
липидсвязывающий белок
МАР артериальное давление
МАРК митоген активируемые киназы
НонитроЬаргинин
кВ фактор транскрипции ядра
конститутивная форма синтазы
i индуцибельная форма
фактор агрегации тромбоцитов
простагландин
фосфолипаза С
РТК протеинтирозинкиназа
липид А из i
ii
фактор некроза опухолей
тапсигаргин
ВВЕДЕНИЕ


Результаты экспериментальных данных, связанных с анализом биологической активности исследуемых ЛПС и коммерческих эндотоксинов. Са2 ответ нейтрофилов крови человека в экспериментах i vi и подавление этих эффектов с ПОМОЩЬЮ ЛПСКЬ. ЛПСкь. ЛПС, различающихся по структуре липида А, изолированных из разных фотосинтезирующих бактерий, от летальных доз эндотоксинов в острых опытах на беспородных мышах. Апробация работы. VIИ Международном конгрессе по фотосинтезу, Стокгольм, международной конференции по углеродному метаболизму бактерий, Монтпелье , конгрессе по патофизиологии, Москва, конгрессе Человек и лекарство, Москва, научной конференции Создание новых лекарственных средств методами химического и биологического синтеза, Москва, научнопрактической конференции Здоровье, профилактика и эндоэкологическая реабилитация новые медицинские технологии, ПущиноСерпухов, международном семинаре Биотехнология Подмосковья, Пущино, , Пущино . Структура и объм диссертации. Диссертация состоит из введения, 3х глав, заключения и выводов. Содержит 5 страниц, включая рисунок и таблиц. Список литературы включает 4 ссылки на работы отечественных и зарубежных авторов. I. Литературный обзор. Генетическая связь между фотосинтезирующими и другими грамотрицательными бактериями. Вопрос о генетическом родстве различных грамотрицательных бактерий является весьма важным, в связи с поиском нетоксичных ЛПС, близких по своей структуре к эндотоксинам. В основу систематики микроорганизмов Берги положено разделение бактерий на микроскопически легко различающиеся формы кокки, палочки, спириллы, окраска но Граму и отношение к молекулярному кислороду аэробы и анаэробы. Основанная на этих принципах искусственная систематика, не позволила проследить филогенетическую связь между бактериями. В связи с этим были предприняты попытки пересмотреть эту классификацию с целью объединения родственных форм, связанных общностью происхождения, и на этом основании воссоздать филогенетическое древо. В качестве маркеров использовались химические признаки, такие как аминокислотная последовательность гомологичных белков, таких как цитохромы . АТФазы , , состав поляргшх липидов I . ЛПС клеточной стенки бактерий . Следует заметить, что никакой из перечисленных выше маркеров не отвечает требованиям, которые можно предъявлять к всеобщем генетическому маркеру. РНК, так как на последовательность их оснований не влияет ни вырожденносгь генетического кода, ни супрессорные мутации. При определении последовательности нуклеотидов рРНК обнаружились как большие различия, так и поразительные черты сходства. В результате составления каталогов нуклеотидных последовательностей рРНК более видов бактерий были выявлены консервативные признаки, которые количественно отразили в коэффициенте сходства. Это привело к созданию дендрограммы или филогенетического древа. В результате такого анализа обнаружились неизвестные ранее взаимосвязи, стали явными родственные отношения, в том числе между отдельными группами фототрофных и нефототрофных грамотрицательных бактерий. Фототрофные бактерии можно найти в 4х из ти филогенетических линий i . Необходимо отметить, что в состав фотосинтезирующих бактерий входят как бактерии, содержащие высокотоксичные ЛИС, например, i i . ЛПС, такие как i ii . Обнаружение филогенетической связи фотосинтезирующих бактерий с другими грамогрицательными бактериями сразу привлекло к ним внимание бактериологов, инфекционистов, иммунологов и др. Связь между различными представителями фототрофных и нефототрофных грамотрицательных бактерий, относящихся к i, иллюстрируется их распределением по субклассам на примерах, представленных в табл. Таблица 1. Выявление нетоксичных фотосинтезирующих бактерий имеет важное практическое и теоретическое значение для понимания связи между структурой и биологической активностью липополисахаридов и их липидов А в отборе природных нетоксичных ЛПС, способных проявлять антагонистические свойства по отношению к эндотоксинам. Расшифровка структуры липида А из нетоксичных ЛПС фсбактерий позволила синтезировать химическим путем вещества, обладающие ярко выраженными эффектами защиты от эндотоксинов.