Особенности антибактериального действия дельта-эндотоксинов Bacillus thuringiensis как перспективного агента защиты растений

• Автор: Левина, Татьяна Александровна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 172 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Микробиометод в системе экологизированной защиты растений
1.2. Bacillus thuringiensis как агент микробиологической защиты растений
1.2.1. Экологическая ниша Bacillus thuringiensis
1.2.2. Факторы токсичности Bacillus thuringiensis
1.3. Кристаллические дельта-эндотоксины Bacillus thuringiensis
1.3.1. Формирование включений
1.3.2. Морфология и ультраструктура кристаллов
1.3.3. Белки кристаллов
1.3.4. Структурно-функциональная организация молекул эндотоксинов
1.3.5. Генетический контроль токсинообразования
1.3.6. Действие дельта-эндотоксинов на целевые объекты
2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Дельта-эндотоксины как фактор антибиотической активности Bacillus thuringiensis
3.2. Влияние дельта-эндотоксинов на окислительный синтез АТФ бактериальными клетками
3.3. Специфика функционирования окислительных систем эндотоксиноустойчивых вариантов Pseudomonas syringae
3.4. Фитозащитная активность дельта-эндотоксинов Bacillus thuringiensis
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА
ПРИЛОЖЕНИЯ
Список сокращений
1. АТФ - аденозинтрифосфат;
2. АТФаза - аденозинтрифосфатаза;
3. 2,4-ДНФ - 2,4-динитрофенол;
4. СДГ - сукцинатдегидрогеназа;
5. ТХУ - трихлоруксусная кислота;
6. ЭДТА - этилендиаминтетраацетат Na;
7. APN - аминопептидаза N;
8. ВТ-препараты - препараты на основе Bacillus thuringiensis и её токсинов;
9. col- (со1еор!ега)-специфичные дельта-эндотоксины - дельтаэндотоксины В.thuringiensis, активные против жесткокрылых;
10.dip- (ё1р1ега)-специфичные дельта-эндотоксины - дельтаэндотоксины В.thuringiensis, активные против двукрылых;
11 Лер- (1ер10ор1ега)-специфичные дельта-эндотоксины - дельтаэндотоксины В.thuringiensis, активные против чешуекрылых;
12.GalNAc - N-ацетилгалактозамин.

Актуальность темы. В последние десятилетия особо остро стоит проблема экологической безопасности технологий, применяемых в агропромышленном комплексе для повышения урожайности и улучшения качества продукции. Одним из решений данной проблемы является ужесточение требований к химическим препаратам и частичная замена их биологическими средствами. В России, однако, при очевидном сокращении объёмов производства пестицидов (с 215 тыс. тонн в 1985 году до 9,7 тыс. тонн в 2000 году) внедрение в сельскохозяйственную практику альтернативных технологий крайне невелико (не более 0,5% от общего объёма использования пестицидов) (Захаренко, 2003; Монастырский, 2003). Применяемые на сегодняшний день биопрепараты производятся преимущественно на основе целых культур микроорганизмов и содержат помимо действующего начала примесь спор, вегетативных клеток, токсинов, что нежелательно с экологической точки зрения. В этой связи особенно перспективно создание средств на основе выделенных и очищенных биологически • активных веществ.
Одним из таких агентов являются кристаллические дельта-эндотоксины, продуцируемые аэробной спорообразующей бактерией Bacillus thuringiensis. Дельта-эндотоксины представляют собой семейство гомологичных белков, оказывающих избирательное действие на насекомых и практически неактивных в отношении теплокровных организмов (Bravo, 1997). На сегодняшний день рынок биопрепаратов на 90-95% представлен спорово-кристаллическими комплексами В.thuringiensis (Вершинина, Алимова, 2000). Создание препаратов на основе чистого эндотоксина позволило бы обеспечить снижение токсической нагрузки на агроценозы.
Некоторые штаммы В.thuringiensis описаны как активные против фитопатогенных бактерий и грибов (Marrone et al., 1999; Кандыбин, Смирнов, 1999; Смирнов, 2000; Климентова, 2001). Антимикробная активность показана также для дельта-эндотоксинов В.thuringiensis (Егоров и соавт., 1990; Юдина, Егоров, 1996; Юдина, Бурцева, 1997; Климентова, 2001; Тюльпинева, 2003). ВышеизМодификацию питательной среды осуществляли добавлением БеБО^ЩО (0,005%) (среда №1).
В ряде экспериментов использовали среду №1, не содержащую Си804х2Н20 (среда №2).
Все питательные среды готовили на дистиллированной воде, контролировали pH в пределах 7,0-7,6.
Для получения твёрдой среды к раствору добавляли выщелоченный микробиологический агар (2%). Бактерии культивировали в чашках Петри на ага-ризованных средах при 281,С.
Выделение и очистку дельта-эндотоксина проводили следующим образом. Биомассу Дд/шп^/енл-лу, содержащую кристаллы эндотоксинов и споры продуцента, отмывали от компонентов питательной среды и водорастворимых токсинов. Для этого биомассу суспензировали в дистиллированной воде, затем центрифугировали при 7000 об/мин в течение 15 мин. Супернатант, содержащий фрагменты питательной среды и водорастворимые токсины, отбрасывали. Осадок ресуспензировали и повторяли очистку (3-4 раза). Степень очистки спорово-кристаллических комплексов оценивали при помощи световой микроскопии. Конечный цснтрифугат содержал кристаллы эндотоксина и споры продуцента (около 40%).
Кристаллы отделяли от снор последовательно, путём флотации и экстракции в двухфазной среде: хлороформ - водный раствор На2БС>4. При этом кристаллы переходят в водную фазу, из которой их осаждали центрифугированием.
Щелочную экстракцию дельта-эндотоксинов проводили, используя метод К. Кукси (Соосзеу, 1968). Для этого кристаллы растворяли в 0,05 М №ЮН в течение 60 мин при 20°С и постоянном перемешивании.
За ходом растворения кристаллов наблюдали при помощи световой микроскопии.
Нерастворившийся материал осаждали центрифугированием при 8000 об/мнн в течение 15 мин.