Исследование геномов внутриядерных симбиотических бактерий рода Holospora методом пульс - электрофореза

• Автор: Тимофеева, Анна Сергеевна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 156 с. : ил.

Оглавление
Введение

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Размер бактериальных геномов

1.2. Линейные хромосомы бактерий.

1.3. Сложно организованные геномы бактерий.

1.4. внутриклеточные симбионты тлей.

1.5. Геномы внутриклеточных симбионтов

инфузорий.

1.6. Симбиотическая система i

Глава 2. Материалы и методы...

i . гэ
2.1. Использованные культуры.
2.2. Культивирование инфузорий.
2.3. Выделение и очистка симбионтов
2.4. Заражение нсинфнцированных клонов i симбиотическими бактериями.
2.5. Приготовление агарозных блоков, содержащих ДНК
.
2.6. Приготовление агарозных блоков, содержащих дрожжевую
2.7. Приготовление агарозных блоков, содержащих конкатемеры ДНК
фага лямбда.
2.8. Обработка агарозных блоков, содержащих ДНК крупнощепящими рсстри стазам и.
2.9. Проведение пульсэлскгрофорсза.
2 Перенос Д1Ж i агарозных гелей на найлоновую мембрану блоттинг
2 Гибридизация па фильтрах блотгибрндизация
2 Определение количества и месторасположения нуклеоидов в клетке

2 Компьютерная обработка полученные результатов.
Глава 3. Результаты
3.1. Получение высокоочнщенных фракций
3.1.1. Выделение и очистка .i и .vi.
3.2. Исследование геномов методом пульсэлектрофореза.
3.2.1. .i.
3.2.2. .vi
3.2.3. ., П.
3.2.4. .
3.3 Количество и расположение нуклеоидов в клетке .
Глава 4. Обсуждение.
4.1. Линейная структура рспликона
4.2. Физические карты геномов .
4.2.1. Физические карты генома исследованных изолятов Н.i,
специфичных к первому сингсну .i.
4.2.2. Физические карты генома исследованных изолятов .i,
специфичных ко второму сингеиу .i.
4.2.3. Физическая карта генома . изолят АБ4
4.2.4.Физическая карта генома . изолят 3
4.3. Размер генома
4.4. Вариабельность геномов .
Выводы.
Список литературы


В течение многих лет исследование бактериальных хромосом проводилось только у нескольких модельных хшкроорганнзмов. ii i, ii, i и i ii, поскольку для этих бактерий могли быть использованы методы классической генетики. При расчете частот рекомбинации между двумя или тремя генетическими маркерами был определен порядок расположения генов на хромосоме и построены генетические карты теномов данных бактерий , , , i, , , . В то время как исследование организации геномов многих свободноживущих, и особенно симбиотических бактерий, важных и интересных с общебиологической точки зрения, не представлялось возможным. Эта ситуация резко изменилась в х годах, когда к решению общебиологических проблем стали привлекаться современные методы молекулярной биологии. Одним из появившихся методов, позволяющих исследовать и сравнивать геномы различных микрорганизмов, был метод гель пульсэлсктрофорсза ПЭФ, предложенный одновременно в двух лабораториях Шварцем с коллегами . , , и Карлом и Олсоном , , . В отличии от обычного электрофореза, пульсэлсктрофорсз позволяет разделять молекулы ДНК от т. ООО т. , , i, . Разделение таких больших молекул ДНК. При этом на разделение той или иной размерной области хромосомной ДНК влияют следующие параметры временной импульс промежуток времени, через который осуществляется переключение электрических нолей, напряжение и длительность проведения электрофореза . Первоначально метод пульсэлсктрофорсза был применен к исследованию геномов эукариот, однако, несколько лет спустя, оказалось, что наиболее адекватно и результативно ПЭФ используется при анализе и характеристике геномов прокариот. Пульсэлектрофорез в сочетании с другими молекулярнобиологическими методами дает возможность исследования геномов бактерий в целом, начиная от определения размера генома, геометрии хромосомной ДНК. i, i, i i , , , . i, i, , геномов. Фактически, появление этого метода было настолько значительным, что стимулировало возникновение новой дисциплины геномики бактерий i i, в рамках которой анализируются данные по физическому картированию и исследованию организации геномов микроорганизмов, принадлежащих к различным систематическим труппам, от i до i , . i, . Так. Исследования бактериальных геномов методом ПЭФ впервые показали, что хромосома бактерий может быть как кольцевой, так и линейной i , , I . i , . При использовании метода ПЭФ для исследования геномов бактерий был обнаружен еще один интересный и неожиданный факт. Оказалось, что бактерии могут содержать несколько хромосом независимых релликонов, каждый из которых содержит жизненно важные гены гены, кодирующие основные метаболические процессы клетки, иили гены обшеклеточных функций. Кроме того, было показано, что геном ряда бактерий может состоять из комбинации нескольких линейных и кольцевых репликонов i, i, , i , . Использование метода пульсэлектрофореза в сочетании с рестрикцией хромосомной ДНК бактерий крупнощепящнми рестриктазамн впервые позволило говорить о вариабельности размера генома и рестрикционного паттерна в пределах различных таксономических единиц. Эти различия были показаны как на уровне видов, так и на уровне более высоких таксонов. Так, например, была отмечена сильная вариабельность рестрикционного паттерна у бактерий, относящихся к роду i . Н. i , i , . . . Iii ii , , разных штаммов ii i i . i . Кроме того, был выявлен консерватизм паттерна рестрикции в пределах некоторых исследованных групп бактерий см.