Использование полимеразной цепной реакции для обнаружения возбудителей сапа и мелиоидоза при экспериментальной инфекции

• Автор: Алтухова, Виктория Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 119 с. : 12 ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Характеристика инфекций, вызываемых патогенными буркхольдериями

1.2. Методы лабораторной диагностики сапа и мелиоидоза

1.3. ПЦР диагностика патогенных буркхольдерий

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Штаммы микроорганизмов, питательные среды, условия культивирования

2.2. Заражение лабораторных животных

2.3. Патоморфологическое исследование биоптатов
2.4. Подготовка проб для проведения ПЦРанализа
2.5. Выделение ДНК
2.6. Постановка полимеразной цепной реакции
2.7. У чт результатов ПЦР 5
2.8. Секвснирование продуктов амплификации
2.9. Статистическая обработка результатов
ГЛАВА 3. ВЫБОР ПРАЙМЕРОВ И ОПТИМИЗАЦИЯ
ПАРАМЕТРОВ ПЦР
3.1. Характеристика праймеров, сконструированных для 5 5 обнаружения В.i, В.i и В. ii.
3.2. Подбор условий постановки реакции амплификации
ГЛАВА 4. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ САПА И
МЕЛИОИДОЗА МЕТОДОМ ПЦР
4.1. Определение аналитической чувствительности и специфичности ПЦР с изучаемыми праймерами при выявлении i и
В. i
4.2. Использование мультиплексной ПЦР для идентификации возбу дителей сапа и мелиоидоза
ГЛАВА 5. ОБНАРУЖЕНИЕ В.i, .i и
.ii i viv
5.1. Использование ПЦР с праймерами 78 и 2 для выявления патогенных буркхольдерий при острых формах инфекций
5.2. Обнаружение В.i методом ПЦР с праймерами 78 и 2 при подострой форме экспериментального мелиоидоза
5.3. Использование реакции амплификации с праймерами 78 и 2 для обнаружения .i при подострой форме экспериментального сапа
5.4. Применение ПЦР с праймерами 2 для обнаружения
.ii у экспериментально заражнных животных
5.5. Исследование продуктов питания и воды, конгаминированных
В.i
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ


Учитывая сказанное, проведение исследований, направленных на поиск оптимальных праймеров для проведения ПЦРанализа и определения места полимеразной цепной реакции в схеме лабораторной диагностики сапа и мелиоидоза остатся актуальным. Совершенствование генодиагностической тестсистемы для выявления патогенных буркхольдерий, оценка е эффективности при диагностике экспериментального сапа и мелиоидоза. Подобрать праймеры на основе нуклеотидных последовательностей флагеллярного и 5 рРНК генов для идентификации типичных и атипичных штаммов патогенных буркхольдерий. Разработать с использованием выбранных праймеров аплификационную тестсистему для обнаружения возбудителей сапа и мелиоидоза. Оценить чувствительность и специфичность выбранных пар олигонуклеотидных затравок при исследовании чистых культур патогенных буркхольдерий и гетерологичных микроорганизмов. Изучить эффективность сконструированной ПЦРтестсистемы при диагностике различных клинических форм сапа и мелиоидоза у экспериментально заражнных животных. Определить диагностическую ценность ПЦР с выбранными праймерами при исследовании воды и продуктов питания, контаминированных возбудителем мелиоидоза. Для идентификации патогенных буркхольдерий на основе нуклеотидной последовательности флагеллярного гена сконструированы оригинальные праймеры 2. Подобраны оптимальные условия проведения ПЦР, обеспечивающие амплификацию фрагментов ДИК В. В.i с высокой чувствительностью и специфичностью. Впервые для молекулярной диагностики сапа и мелиоидоза разработана амплификационная тестсистема с использованием двух пар праймеров 2 и 78, полученных на основе флагеллярного и рРНК генов. Продемонстрирована высокая эффективность использования ПЦР с двумя парами праймеров для диагностики различных клинических вариантов сапной и мелиоидозной инфекций, вызванных типичными и атипичными штаммами В. В. i. Показана возможность использования разработанной ПЦРтестсистемы для анализа воды и продуктов питания, контаминированных В. Для выявления триады буркхольдерий В. Впервые показана диагностическая ценность праймеров 1 а2 для идентификации . ПЦР при анализе чистых культур микроорганизмов и исследовании биологического материала, полученного от животных, экспериментально зараженных этим микроорганизмом. Дополнена схема лабораторной диагностики сапа и мелиоидоза и идентификации патогенных буркхольдерий. Выбранные праймеры используются в лабораториях Волгоградского НИ1ТЧИ для анализа музейных штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза, изучения генетически измененных штаммов патогенных буркхольдерий. .i. Разработанная ПЦРтестсистема с применением праймеров Ь78 и 1 2 может быть использована для исследования клинического материала, взятого у лиц с подозрением на заболевание сапом и мелиоидозом, анализа пищевых продуктов и объектов, подозрительных на контаминацию . .ii. Материалы диссертации включены в Программу курсов повышения квалификации бактериологов и эпидемиологов по противодействию биотерроризму, утвержденную Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Г.Онищенко г. Материалы диссертационного исследования вошли в Практическое пособие для подготовки врачейбактериологов и эпидемиологов по вопросам противодействия биотерроризму Волгоград, г. С.И. Ивановым г. По результатам работы проведены внутриинститутские примочные испытания акт утверждн директором Волгоградского НИПЧИ г. Разработан пакет первичной документации Инструкция по изготовлению и контролю амплификационной тестсистемы для выявления i i и i i и Инструкция по применению амплификационной тестсистемы для выявления i i и i i, утвержднные директором Волгоградского НИПЧИ г. По материалам диссертационной работы составлены методические рекомендации Идентификация возбудителей сапа и мелиоидоза методом полимеразной цепной реакции, утверждены директором Волгоградского НИПЧИ г. Использование двух пар праймеров для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза методом ГТЦР, утверждены директором Волгоградского НИ ГЧИ г.