Эндонуклеаза бактерий Serratia marcescens в эволюционном ряду родственных нуклеодеполимераз

• Автор: Филимонова, Мария Николаевна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 341 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. ЭВОЛЮЦИЯ БЕЛКОВ

2.1.1. Способы обнаружения отдаленных родственных связей

2.1.2. Конвергентная эволюция белков

2.1.3. Дивергентная эволюция

2.1.4. Множественные формы белков как объект эволюционного развития на молекулярном и клеточном уровне

2.1.5. Множественность форм нуклеодеполимераз и их функциональная активность

2.2. ЭНДОНУКЛЕАЗА БАКТЕРИЙ I

2.2.1. Бактерии i и их патогенность

2.2.2. Экспрессия гена и секреция эндонуклеазы
2.2.3. Свойства эндонуклеазы
2.2.4. Структура фермента
2.2.5. Механизм действия
2.2.6. Сравнение эндонуклеазы i с другими нуклеодеполимеразами про и эукариот
2.3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Характеристика продуцентов
3.2. Условия культивирования
3.3. Измерение ферментативных активностей
3.4. Инактивация под действием тепла
3.5. Гидролиз
3.6. Хроматография
3.7. Электрофорез
3.8. Изоэлектрофокусирование
3.9. Определение аминокислотного состава
3 Масс спектрометрия
3 Спектроскопия в ультрафиолете
3 Ультрацентрифугирование
3 Сшивание бифункциональным реагентом диметилсуберимидатом
3 Получение комплексов ДНК с катионами металлов
3 Иммуноферментный анализ
3 Статистическая обработка результатов
4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
4.1. РАЗРАБОТКА ПРЕПАРАТИВНЫХ МЕТОДОВ
ВЫДЕЛЕНИЯ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ БАКТЕРИЙ I
4.1.1. Метод выделения гомогенного препарата из концентрата
белков культуральной жидкости
4.1.2. Метод выделения эндонуклеазы из культуральной жидкости
4.2. РАЗРАБОТКА МЕТОДА ВЫДЕЛЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНЫХ
ФОРМ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ
4.2.1. Спектр молекулярных форм эндонуклеазы i у
разных штаммов и в разных условиях культивирования
4.2.2. Разработка метода разделения молекулярных форм
4.2.3. Выделение молекулярных форм из высокоочищенного
препарата эндонуклеазы
4.2.4. Выделение молекулярных форм в препаративных количествах
4.3. ФИЗИКО ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МОЛЕКУЛЯРНЫХ ФОРМ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ
4.4. СТРУКТУРНЫЙ АНАЛИЗ
4.4.1. Аминокислотный состав
4.4.2. Аминокислотная последовательность молекулярных
форм эндонуклеазы
4.4.3. Конформационное различие множественных форм эндонуклеазы
4.4.4. Структурная организация молекулярных форм эндонуклеазы
4.5. БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МОЛЕКУЛЯРНЫХ
ФОРМ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ
4.5.1. Оптимальные значения , температуры, концентрации 2
4.5.2. Механизм взаимодействия молекулярных форм эндонуклеазы
с катионами
4.5.3. Субстратная специфичность молекулярных форм эндонуклеазы
5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
6. ВЫВОДЫ
7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
8. ЛИТЕРАТУРА
9. ПРИЛОЖЕНИЯ
1. ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Например, любой представитель мира позвоночных животных является гетерозиготным примерно по 7 генных локусов, кодирующих структуру ферментов. У беспозвоночных организмов средняя степень гетерозиготности на один локус примерно вдвое выше, чем у позвоночных i Н. i . . ДНК, что и продемонстрировано на примере ДНКазы I ЮбЫ К. Образование множественности аллелей и генных локусов происходит путем дивергентной эволюции. Множественные аллели возникают в результате точечных мутаций в исходном гене. По мере проявления преимуществ гетерозиготности образовавшиеся аллели распространяются в популяции. Предполагается, что полиморфизм представляет собой промежуточный этап эволюции, на котором один аллель может постепенно замещаться другим, более полезным. Поскольку любая гетерозиготная особь передает потомкам только по одному аллелю, распространение благоприятного аллеля от момента появления до полного замещения предшествовавшего аллеля займет многие поколения, и в это период в популяции будут присутствовать оба аллеля Райдер К. Тейлор К. Пути возникновения множественности генных локусов являются в настоящее время предметом для дискуссий. Другой схематически может быть представлен следующим образом сначала происходит мутация генапредшественника, образуется множественность аллелей. Затем идет удвоение локуса. После этого сегрегация аллелей в первом локусе остается только один аллель, а во втором только другой. В конце образуются независимые механизмы регуляции экспрессии множественных локусов, кодирующих изоферменты, что у высших организмов часто проявляется тканеспецифичностью изоферментов Райдер К. Тейлор К. Изоформы ферментов это белки, одна из форм которых может превращаться в другую, различие которых связано с посттрансляционной модификацией продукта трансляции одного и того же гена. Белки, связанные с другими группами, и белки, происходящие от одной пол и пептидной цепи. Полимеры, состоящие из единственной субъединицы. Формы, имеющие разную конформацию конформеры. Последнее сильно затрудняет разделение сформировавшихся таким путем изоформ. Примером конформеров является кислая фосфатаза из эритроцитов млекопитающих i Н. Несмотря на признание того, что конформационные изменения совершенно необходимы для функционирования большинства ферментов, несмотря на представление о том, что некоторые белковые молекулы с одной и той же аминокислотной последовательностью могут существовать в виде различных вариантов, примером чему служит сывороточный альбумин i М. Диксон М. Э., . Не вызывает сомнения образование изоформ ферментов в результате связывания с другими группами. АМФзависимой протеин киназы, амидирования аминокислотных остатков с отрицательно заряженными боковыми группами или наоборот дезаминирования амидов фосфодезоксирибомутазы . РНКазы I В. . i . . . . . . Образование изоформ также может происходить в результате восстановленияокисления дисульфицных связей или сульфгидрильных групп или ограниченного протеолиза . Несмеянова М. А. и др. Таким образом, различия между полипептидами, образующими протомерные или олигомерные молекулы изоформ невелики. Причины, приводящие к образованию изоформ ферментов справедливы как для про так и эукариот. Изоформы ферментов, в отличие от изоферментов, не всегда различаются между собой по каталитическим параметрам и, как следствие, по каталитической функции в организме. Однако известны примеры того, что даже незначительная посттрансляционная модификация может приводить к изменению функциональных характеристик изоформ ферментов. Так, каталитическая активность и свойства киназы фосфорилазы зависят от того, в фосфорилированном или дсфосфорилированном состоянии находится этот фермент i . Ксантиноксидаза переходит из одной формы, функционирующей как дегидрогеназа, в другую оксидазную при хранении фермента при и обработке ионами меди, кобальта, дисульфидными и сульфгидрилъньгми реагентами i . i .