Идентификация нетуберкулезных микобактерий и выбор оптимальной комбинации методов для их видовой дифференциации

• Автор: Майорова, Ангелина Александровна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Оболенск
• Количество страниц: 148 с. : ил.

Оглавление.

Принятые обозначения и сокращения

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Микобактерии общая характеристика.И

1.2. Таксономия.

1.3. Микобактериозы.

1.4. Чувствительность к лекарственным препаратам

нетуберкулезных микобактерий

1.5. Характеристика основных патогенных

нетуберкулезных микобактерий

1.5.1 Медленнорастущие микобактерии.
1.5.1.1 .М. vix.
1.5.1.2. М ii.
1.5.1.3. М .
1. 5.1.4. М .
1.5.1.5. М. i.
1.5.1.6. М. xi
1.5.1.7. М.
1.5.1.8. М i
1.5.2. Быстрорастущие микобактерии
М , М. i, ..
1.6. Методы видовой идентификации.
1.6.1. Детекция микобактерий
1.6.2. Дифференциация нетуберкулезных микобактерий и микобактерий
туберкулезного комплекса
1.6.2.1. Культуральные методы, применяемые
для идентификации М. i.
1.6.2.2. Молекулярногенетические методы, применяемые
для идентификации М. i.
1.6.3. Идентификация нетуберкулезных микобактерий.
1.6.3.1. Идентификация нетуберкулезных микобактерий с помощью культуральных и биохимических тестов
1.6.3.2. Высокопроизводительная жидкостная хроматография
i ii .
1.6.3.3. Газожидкостная хроматография.
1.6.3.4. Идентификация нетуберкулезных микобактерий, основанная
на генетических различиях.
1.6.3.4.1. Методы, основанные на гибридизации.
1.6.3.4.2. Полимеразная цепная реакция
ГЛАВА 2. Материалы и методы.
2.1. Бактериальные штаммы.
2.2. Микробиологические методы
2.2.1. Бактериоскопический метод
2.3. Культуральные методы исследования
2.3.1. Рост микобактерий при разных температурах
2.3.2 Скорость роста микобактерий.
2.3.3. Пигментация колоний микобактерий.
2.3.4. Рост микобактерий на средах с салициловокислым натрием и
с паранитробензойной кислотой.
2.3.5. Рост микобактерий на среде с 5 хлористым натрием
2.4. Биохимические методы.
2.4.1. Ниациновый тест
2.4.2 Определение каталазной активности.
2.4.3. Определение термостабильности каталазы.
2.4.4. Определение нитратредуктазной активности.
2.4.5. Определение амидазной активности.
2.5. Определение лекарственной устойчивости i vi
2.6. Молекулярногенетические методы
2.6.1. Выделение микобактериальной ДНК
2.6.2. Амплификация I60 элемента.
.3. Метод сполиготипирования
2.6.4. ПЦР секвенирование фрагмента гена,
кодирующего синтез рРНК.
2.6.5. Метод рестрикционного анализа амплифицированного фрагмента спейсерной последовательности рибосомной ДНК
2.7. .
Глава 3. Результаты.
3.1. Исследуемый материал.
3.2. Идентификация культур туберкулезного комплекса.
3.3. Культуральные и биохимические характеристики штаммов нетуберкулезных микобактерий
3.4. Использование ПЦРсеквенирования гена рРНК для видовой идентификации нетуберкулезных микобактерий
3.5. Исследование коллекции штаммов нетуберкулезных микобактерий методом рестрикционного анализа амплифицированного фрагмента спейсерной последовательности рибосомной ДНК
3.6.
3.7. Лекарственная устойчивость нетуберкулезных микобактерий
Глава 4. Обсуждение
Выводы.
Список литературы


Проведена сравнительная характеристика методов, используемых для идентификации НТМБ ПЦРсеквенирование гена рРНК, рестрикционный анализ амплифицированного фрагмента спейсерной последовательности рибосомной ДНК и для применения в повседневной практике. Применение культуральных и биохимических тестов и ПЦРсеквенирование гена рРНК в случаев позволяет определить видовую принадлежность НТМБ. Обнаружена внутривидовая вариабельность вида М i. При использовании метода рестрикционного анализа амплифицированного фрагмента спейсерной последовательности рибосомной ДНК выявлено пять геногрупп данного вида микобактерий. При определении лекарственной устойчивости клинических и лабораторных штаммов НТМБ к основным противотуберкулезным препаратам стрептомицину, изониазиду, канамицину, этамбутолу и рифампицину выявлена высокая устойчивость к этим препаратам. Выявлено, что среди НТМБ, выделенных от больных легочной формой микобактериозов, проживающих в Центральном и Приволжском федеральных округах России, преобладают виды М. М. кат аз и. Создана коллекция НТМБ, включающая штамма, относящихся к десяти видам. Глава 1. Обзор литературы. Микобактерии общая характеристика. История изучения микобактерий началась в конце века. В году А. Хансен открыл палочку лепры i , а Р. Кох в году туберкулезную палочку i i 9. Эти два представителя одного рода известны как возбудители одних из древнейших болезней человека лепры и туберкулеза. В году К. В. и . предложили ввести в систематику бактерий новый род i и включенные в него виды М. М. 4. Вскоре стали появляться сообщения об открытии других представителей этого рода сапрофитных бактериях, широко распространенных в природе . В настоящее время род i включает в себя свыше видов , 1. Согласно определителю Берджи, группа микобактерий содержит единственный род i 7. ДНК исключением является М. Кислотоустойчивость не позволяет обесцвечивать клетки микобактерий кислотами, щелочами или этанолом после окрашивания. Это свойство является характерным для микобактерий. Некоторые другие бактерии, такие как i и частично кислотоустойчивы. Они легко обесцвечиваются спиртом, но могут проявлять устойчивость к действию слабой кислоты. В результате чего они ошибочно могут быть отнесены к микобактериям 7. ЦиляНил ьсена 7. Микобактерии легко убить прогреванием выше С в течение минут или обработкой ультрафиолетовыми лучами, но не замораживанием или высушиванием. Микобактерии более резистентны к некоторым химическим дезинфектантам, чем большинство других неспорообразующих бактерий , 9,0, 7. Микобактерии тонкие палочковидные клетки 0. Морфология колоний различается внутри видов от гладких до сухих и от непигментированных до пигментированных. Культуры могут быть окрашены в желтый, оранжевый или реже розовый цвета за счет образования каротиноидных пигментов 7, 9. Вследствие большого количества липидов, большинство микобактерий не образует гидрофильного наружного слоя и является настоящими гидрофобами. Это выражается в тенденции образования восковидной пленки при культивировании их на жидкой среде без перемешивания. Бактериальная культура при отсутствии в среде детергента образует хлопья 4. Микобактерии растут медленно и очень медленно 7,, 4, 9. Большинство видов микобактерий адаптировано к росту на сравнительно простых субстратах, содержащих аммоний или аминокислоты в качестве источников азота, глицерин, как источник углерода и минеральные соли , 9. Некоторые виды микобактерий проявляют большую требовательность к составу среды или нуждаются в специальных добавках и не растут на обычных средах, применяемых для культивирования М. Для успешного культивирования М. М vi в среде должны присутствовать микобактин или экзохелин, М i нуждается в гемине, М. М. способны расти только при строго определенных значениях , для роста М. М. не удается культивировать на искусственных питательных средах 7,, 9.