Изучение роли плазмид Azospirillum Brasilense в образовании липополисахаридов, содержащих пента-D-рамнановый O-полисахарид

• Автор: Кулибякина, Ольга Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 108 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Бактерии рода АгойрмИит как модельный объект в исследовании

молекулярных основ ассоциативного взаимодействия бактерий и растений

1.2 Мажорные полисахаридные компоненты клеточной поверхности

грамотридательных бактерии

.2.1 Структура и биологическая роль липида А ЛПС

1.2.2 Структура и биологические функции кора ЛПС

1.2.3 Структура, биосинтез и биологическая роль Оспецифического

полисахарида ЛПС

1.2.4 Получение и характеристика мутантов А. ЬгазИепэе по продукции

липонолиеахаридов и полисахаридов, связывающих калькофлуор
1.3 Образование биоплепок как важнейшая стратегия приспособления
микроорганизмов к окружающей среде
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Штаммы и плазмиды
2.2 Питательные среды и условия выращивания бактерий
2.3 Препаративное выделение плазмидной ДНК
2.4 Выделение тотальной ДНК из бактерий
2.5 Манипуляции с ДНК и блоттинггибридизация ДНК
2.6 Секвенирование ДНК. Анализ открытых рамок считывания и
харакгсристика предполагаемых продуктов их экспрессии
2.7 Полимеразные цепные реакции
2.8 Оценка способности бактерий к формированию бионленок
2.9 Определение относительной гидрофобности бактериальной
поверхности
2. Получение антител и иммуноферментный анализ биопленок
2. Статистическая обработка результатов
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Использование методов биоинформатики и молекулярной генетики для изучения функций плазмид А.Ьгазепхе
3.1.1 Общая характеристика нуклеотидной последовательности т.п.н. Х1ю фрагмента 0МДа плазмидьт и З.Зт.п.н. сегмента МДа плазмиды А. ЬгаИепзе Бр
3.1.2 Идентификация шести генов гликозилтрансфераз в плазмидах Л.ЬгазИепзе Бр5 р0 и р
3.1.3 Характерно и ка предсказанных продуктов экспрессии огЗ и ог4, выявленных в р
3.1.4 Характеристика предсказанных продуктов экспрессии ог5 и ог6, локализованных в р
3.1.5 Поиск последовательностей, гомологичных фрагментам р 0 и р из А. i. Бр5, в геномах А. i. Бр7, Бр 7 и
3.2 Анализ влияния мутаций в синтезе липололисахаридов и
полисахаридов, связывающих капькофлуор, на формирование биопленок А. i. 8р
3.2.1 Относительная гидрофобность клеточной поверхности Л. Ьгаь йете Бр5 и его мутантов по образованию ЛПС и ПССК
3.2.2 Оценка выраженности бактериальных пленок, образуемых штаммом
А Ьгаьете Эр5 и его мутантами, на поверхности стекла и пластика
3.2.3 Сравнение биопленок, формируемых А. Ьга8еп8в 8р5 и его мутантами, с использованием иммуноферментного анализа
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Воронин, i i, i, i , i, . Сравнительно недавно описано ассоциативное взаимодействие клубеньковых бактерий со злаками . Одним из наиболее интенсивно изучаемых ассоциативных партнеров растений стали альфапротеобактсрии рода ii из семейства ii. Азоснириллы обладают разнообразными двигательными органеллами и тактическими реакциями, очень гибким метаболизмом, способностью к обитанию в разнообразных климатических поясах и экологических нишах в почве, воде, на подземных и надземных органах растений, в корнях и др. Баканчикова с соавт. Кацы, , Шелудько и Кацы, x . V, i i, . Основной формой существования микроорганизмов в природе, повидимому, являются биопленки пространственно и метаболически структурированные сообщества, заключенные в экстраклеточный полимерный матрикс Николаев и Плакунов, Романова с соавт. Какихлибо сведений об особенностях формирования биопленок азоспирилл и роли в этом процессе их экетраклеточных полимеров к началу наших работ не было. Среди полимеров клеточной поверхности азоспирилл доминируют липополисахаридм ЛПС, , опосредующие первые этапы взаимодействия этих бактерий с растениями Федоненко с соавт. Выяснена структура повторяющегося звена ОПС являющегося пентарамнаном ЛПС штаммов . Бойко с соавт. Федоненко с соавт. Сведения о строении липида А и кора ЛПС . Для азоспирилл характерна способность к образованию полисахаридов, связывающих прижизненный краситель калькофлуор ПССК СаГ фенотип. ПССК . ЭПС и капсульными полисахаридами КГ1С . Отсутствие флуоресценции колоний на средах с калькофлуором СаГ фенотип использовано для отбора мутантов А. ПССК . Работы, посвященные генетическим аспектам образования ЛПС и ПССК у азоспирилл, пока немногочисленны. Как у многих других альфапротеобактернй, существенную часть многокомпонентного генома азоспирилл составляют крупные плазмиды, повидимому, важные для обеспечения экологического успеха бактерийхозяен ii . V, Кацы, , , . В МДа плазмиде i типового штамма . ПС V . Использование омегонового мутагенеза позволило выявить в 0МДа плазмиде р 0 . I и II, имеющих различия в антигенной структуре и заряде, по содержащих ОПС с одинаковым повторяющимся звеном . Федоненко с соавт. Мутагенез двух из этих локусов р 0 привел к дефектам в образовании не только ЛПС, но и ПССК . Более тонкий анализ функций и свойств р 0 и других плазмид азоспирилл представляется одной из важнейших предпосылок выяснения молекулярных механизмов ассоциативного взаимодействия этих микроорганизмов с растениями. Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы явилась идентификация в плазмидах . Анализ нуклеотидной последовательности т. ХИо фрагмента 0МДа плазмиды А. ЬгазИепяе 8р5, мутагенез которого сопровождается изменениями в структуре ЛПС. Поиск генов, продукты которых могут участвовать в биосинтезе полисахаридов, в клонированном фрагменте МДа плазмиды р А. ЬгахИепяе Яр5. Характеристика предполагаемых продуктов экспрессии кодирующих последовательностей, выявленных в р 0 и р, с использованием методов биоинформатики. Поиск локусов, гомологичных секвснированным фрагментам р 0 и р, в ДИК штаммов А. ЛПС которых содержат ОПС с такой же, как у Яр5, или иной структурой повторяющегося звена. Сравнительный анализ биопленок, формируемых на абиотических поверхностях штаммом А. Яр5 и его мутантами по образованию ЛПС и ПССК. Научная новизна работы. В плазмидной ДНК модельного штамма А. ЬгаБИете Яр5 впервые идентифицированы гены предсказанных гликозилтрансфераз, участвующих в синтезе кора ЛПС, ОПС и ЭГ1С. Установлено, что инсерционный мутагенез гена р 0, кодирующего АДФгептозаЛПСгсптозилфансфсразу один из ферментов синтеза корового олигосахарида ЛПС, приводит к утрате Ьрз1 с кислой углеводной компонентой, но не влияет на образование ТрзП с нейтральной углеводной компонентой и такой же, как у Ьрв, структурой повторяющегося звена ОПС пентаОрамнан. В 0МДа плазмиде штамма А. ЬИете Яр 7, ОПС которого, как и у 8р5, является лентаОрампаном, впервые выявлен высокий уровень гомологии с сегментом р 0, содержащим гены ферментов синтеза кора ЛПС, ОПС и ЭПС.