Выявление, типирование и молекулярно-генетическая характеристика Coxiella burnetii

• Автор: Фрейлихман, Ольга Александровна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 118 с. : ил.

Оглавление
ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК ТЕРМИНОВ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ .4 ВВЕДЕНИЕ.

1. Актуальность темы . .

2. Цель работы .

3. Залами исследования

4. Научная новизна .

5. Практическая значимость .

6. Положения, выносимые на защиту .

7. Апробация работы

8. Личный вклад дисссртанга. ...

9. Структура и объем диссертации
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1. Биологические свойства С. ii
2. Характеристика генома С. ii
3. Методы идентификации и дифференциации коксиелл биологические, серологические, иммунологические, молекулярнобиологические.
I. Мегоды идентификации
Методы культивирования С. ii.
Биологические мегоды идентификации.
Серологические методы
Молекулярногенетические методы
ПЦР в формате реальною времени.
И. Методы дифференциации С. ii и опенка генетической однородности мировой популяции коксиелл.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
1. Материалы .
1.1. Штаммы С. ii
1.2. Биологический материал
1.3. ДНК микроорганизмов для контроля специфичности реакции ГЦР и ГЦРРВ.
2. Мегоды
2.1. Культивирование С. ii для накопления биомассы.
2.1.1. Культивирование на куриных эмбрионах
2.1.2. Культивирование в культуре клеток.
2.2. Очистка от тканевых примесей
2.3. Подсчет количества клеток С. ii в материале.
2.4. Выделение ДНК.
2.5. Дизайн праймеров
2.6. Полимеразная цепная реакция.
2.7. Электрофорез в агарозном геле
2.8. ПЦР в формате реального времени
2.9. Выделение ДНК из агарозного геля.
2 Рестрикция
2 Секвенированнс
2 Статистическая и компьютерная обработка данных
П. РЕЗУЛЬТАТЫ.
ГЛАВА 3. ОПТИМИЗАЦИЯ ПЦР ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ С. II В
ПОЛЕВОМ И КЛИНИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ.
ГЛАВА 4. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ТЕХНОЛОГИЙ ПЦРРВ I И ПЦРРВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ И ОЦЕНКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО СОДЕРЖАНИЯ С. II В ОБРАЗЦАХ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА
1. ПЦРРВ, технология I.
2. ПЦРРВ, технология .
ГЛАВА 5. МОЛЕКУЛЯРНОГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ С. II.
1. Анализ полиморфизма длин фрагментов рестрикции.
2. МультнспеПсертнпнрованне
3. Распределение штаммов по типу плазмид и типу сиквенса генов и сот.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


В России проведено исследование по выявлению возбудителя Кулихорадки в полевом материале путем амплификации фрагмента гена белка теплового шока, vi . i . Однако метод ПЦР до настоящего времени не нашел широкого применения при мониторинге природных очагов Кулнхорадки. Таким образом, недостаток сведений о структуре природных популяций С. России, несовершенство существующих методов их обнаружения в природных и хозяйственных очагах диктуют необходимость внедрения молекулярногенетических методов быстрого выявления и типирования коксиелл в полевом материале. Кулихорадки в биологическом материале и генотипическая характеристика штаммов С. Оптимизировать метод ПЦР для выявления С. Оценить эффективность различных модификаций метода ПЦР в формате реального времени ПЦРРВ для выявления С. Провести генотипирование штаммов мировой коллекции С. России, с помощью метода анализа полиморфизма длин фрагментов рестрикции амплифицированного гена i и мультиспсйсертипироваштя хромосомной ДНК анализ нуклеотидных последовательностей множественных межгенных участков спейсеров. Изучить генетические связи между штаммами С. ДНК. С использованием метода мультиспейсертипирования и анализа длин фрагментов рестрикции гена изучена генетическая структура популяции С. России. На основе филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей множественных спейсеров установлено, что на территории Российской Федерации циркулируют штаммы С. и 7 . Впервые для качественного и количественного определения фрагмента гена i С. Кулихорадки применен метод ПЦРРВ. С. ii и одна нуклеотидная последовательность фрагмента гена штамма Ix3Луга, протяженностью 4 п. . Научно обоснована перспективность применения метода мультиспейсертипирования для дифференциации штаммов С. Разработан и апробирован метод ПЦРРВ в модификации с использованием праймеров i и сконструированного зонда детекции, меченного флуоресцеином, для выявления и количественного определения фрагмента гена i штаммов С. Кулихорадки. Показано, что по показателям чувствительности и специфичности технология ПЦРРВ с использованием сконструированного зонда детекции, меченного флуоресцеином, превосходит технологию ПЦРРВ I с использованием интеркалирующего красителя. Разработаны методические основы оптимизации метода ПЦРРВ для выявления возбудителя у больных на ранних стадиях заболевания Кулихорадкой. Установлена инфицированность С. СанктПетербурга в г. Кулихорадки. ПЦР с сконструированными праймерами, ограничивающими фрагмент гена , высоко эффективна для выявления С. ПЦРРВ с применением сконструированного зонда, меченного флуоресцеином технология , оптимальна для количественного определения С. Штаммы С. России, по результатам анализа полиморфизма межгенных участков хромосомной ДНК, принадлежат к генотипам и 7. Метод мультиспейсертипирования эффективен для генотипической характеристики штаммов С. Результаты работы доложены на Международной конференции по риккетсиям и риккетсиальным болезням Любляна, Словения, 47 сентября г. Всероссийского научнопрактического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов в СанктПетербурге и Ленинградской области СанктПетербург, мая г. Четвертой международной конференции, посвященной летию СанктПетербургского НИИЭМ имени Пастера и 0летию Парижского института Пастера Идеи Пастера в борьбе с инфекциями СанктПетербург, 24 июня г. Формулирование целей и задач, подбор методов исследования выполнены лично диссертантом. Автором лично проводился дизайн праймеров и зондов для ГГЦРРВ и оптимизация ПЦРРВ, лабораторные исследования биологического материала методами Г1ЦР и ПЦРРВ, амплификация и секвенирование межгенных промежутков штаммов российской коллекции С. Соавторами осуществлялась консультативнометодическая помощь и предоставление технической базы для выполнения работы. Диссертационная работа состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, списка литературы отечественных и 1 зарубежных источников.