Изучение поверхностных полисахаридных антигенов штаммов Vibrio cholerae O139 различного происхождения с использованием моноклональных антител

• Автор: Чемисова, Ольга Сергеевна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Ростов-на-Дону
• Количество страниц: 149 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Характеристика липополисахарида и капсулы V

1.2. Серологические методы диагностики возбудителя холеры

серогрупиы

1.3. Моноклональные антитела в изучении холерных вибрионов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Лабораторные животные.

2.2. Бактериальные штаммы

2.3. Клеточные линии позвоночных.
2.4. Питательные среды и реактивы
2.5. Гибридизация клеток.
2.6. Клонирование гибридом.
2.7. Культивирование гибридом i vi и i viv.
2.8. Криоконсервирование гибридом
2.9. Очистка иммуноглобулинов
2 Конъюгирование иммуноглобулинов с ФИТЦ.
2 Метод иммунофлюоресценции
2 Иммуноферментные методы .
2 Иммунодиффузия в геле по Оухтерлони
2 Реакция агглютинации.
2 Методы получения препаратов Л ПС и оценки их чистоты.
2 Метод получения белков наружной мембраны.
2 Электрофорез в полиакриламидном геле.
2 Метод тонкослойной хроматографии.
2 Иммуноблоттинг.
2 Методы статистической обработки результатов
ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ЛИПОПОЛИ
САХАРИДУ V СНОЬЕЛАЕ
3.1. Характеристика препаратов Л ПС, выделенных
из клеток холерных вибрионов серогруппы.
3.2. Получение гибридомпродуцентов моноклональных антигел
к ЛПС V скоегае и их первичный скрининг
3.3. Изучение специфичности и активности МКА
в серологических методах.
3.4. Определение класса и подкласса моноспецифических иммуноглобулинов.
3.5. Исследование эпитопной направленности МКА.
3.6. Получение препаративных количеств МКА, их очистка.
ГЛАВА 4. АНТИГЕННЫЕ СВОЙСТВА ШТАММОВ
V. СНОЬЕНАЕОт РАЗЛИЧНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
4.1. Харакгеристика иммунохимической активное и
штаммов V сИокгае , выделенных от человека и из воды
4.2. Сравнительное изучение антигенной структуры
клинических и водных штаммов V сИо1егае
ГЛАВА 5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ
МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ЛПС.
5.1. Иммунофлуоресцентный диагностикум на основе
МКА для идентификации штаммов V сИо1егае .
5.2. Исследование полисахаридных антигенов штаммов
V. сИокгае , измененных по признаку агглютинабельности,
и некультивируемых форм.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Нетоксигенные холерные вибрионы были изолированы и из воды поверхностных водоемов на территории Российской Федерации в Московской, Новосибирской, Ростовской областях, а также в Республике Калмыкия Ганин . . с соавт. Кюрегян . . с соавт. Ломов Ю. М. с соавт. Кругликов В. Д. с соавт. В результате многочисленных исследований установлено, что отсутствие в хромосоме структурных генов холерного токсина является основной причиной авирулснтности большого числа штаммов серогруппы . . . Показано, что штаммы, выделенные из объектов окружающей среды, лишены тестируемых генов, связанных с вирулентностью, тогда как клинические обладали полным набором этих детерминант Осин . . с соавт. Выявлены различия в ПЦРгенотипах Мишанькин Б. Н. с соавт. Осин . . с соавт. Шиманюк Н. Я. и др. Дуванова О. В., . Ерошенко Г. А. с соавт. V и созданы зонды на гены и рРНК, позволяющие дифференцировать вирулентные и авирулентные штаммы серогруппы. В то же время, обнаружены и сходные признаки экспрессия внеклеточных нротсаз, наличие полисахаридной капсулы Осин . . с соавт, . Показана способность авирулентных вибрионов агглютинироваться поликлональной сывороткой, полученной к вирулентному штамму Бенгал, что указывает на структурное сходство Оантигенов, определяющих их серологическую специфичность. Однако данных о более детальном исследовании антигенных детерминант, входящих в состав клеточной поверхности вибрионов серогруппы, выделенных из воды, в доступной литературе мы не обнаружили. .Г. Кожухов И. Г. с соавт. Ломов Ю. М. с соавт. Подосинникова Л. С. с соавт. Кюрегян . . с соавт. .Е. И если изучению ЛПС таких измененных вариантов V. i Т. i . . Сомова А. Г. с соавт. Гальцева Г. В. с соавт. Седина С. Г., Цитцср А. О., Черепахина И. Я. с соавт. Алексеева Л. П. с соавт. V практически отсутствуют. Использование поликлональных Оспецифических сывороток не всегда позволяет выявить особенности антигенной структуры различных вариантов вибрионов серогруппы. В большей степени для этой цели пригодны моноклональные антитела МКА. В отечественной литературе на момент начала нашего исследования отсутствовали сведения о получении МКА к ЛПС V. Нам представляется, что привлечение последних для более детального исследования антигенной структуры штаммов , выделенных из воды, поможет установить их подлинное место среди представителей вида V сИокгае. Получение моноклональных антител к линоиолисахариду V скокгае и их применение для изучения антигенной структуры штаммов холерных вибрионов серогруппы различного происхождения и разработки экспериментальных диагностических препаратов. Выделить и очистить препараты ЛПС из клеток штаммов V скокгае , выделенных от человека и из воды, изучить их состав и иммунохимическис свойства. Получить гибридомыпродуценты МКА к ЛПС V сИокгае , охарактеризовать их свойства. Использовать МКА к ЛПС для иммунохимического анализа поверхностных полисахаридов вибрионов серогруппы различного происхождения. Изучить изменения антигенной структуры у инагглютинабельных и некультивируемых форм холерных вибрионов серогруппы с помощью МКА. Исследовать возможность использования МКА в качестве диагностических реагентов, разработать на их основе препараты для детекции штаммов V. Впервые создана панель гибридомпродуцентов моноклональных антител строго специфичных в отношении Л ПС и микробных клеюк возбудителя холеры серогруппы. Показано отсутствие перекрестной активности МКА с микроорганизмами, имеющими антигенное родство с холерными вибрионами Бенгал. Установлено, что МКА направлены к эпитопам полисахаридной части ЛПС. Получены приоритетные сведения, касающиеся структуры ЛПС штаммов V сИокгае , выделенных от человека и из воды поверхностных водоемов России. Установлено, что штаммы водного и клинического происхождения имеют сходный эпитопный состав ЛПС, однако клинические штаммы проявляют более высокую антигенную активность в иммунофермснтных методах, что обусловлено более плотным экспонированием полисахаридных детерминант на клеточной поверхности.