Изучение капсульных и бескапсульных форм Vibrio cholerae 0139 с использованием поли- и моноклональных антител

• Автор: Терешкина, Наталия Евгеньевна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 206 с.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 1. ХАРАКТЕРИСТИКА КАПСУЛЬНЫХ АНТИГЕНОВ И

ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ

ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ИММУНОДИАГНОСТИКИ

ХОЛЕРЫ, ВЫЗЫВАЕМОЙ УСНОЬЕЯАЕ СЕРОГРУППЫ

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Бактериальные штаммы

3.2. Антигены и сыворотки

3.3. Клеточные линии и культуральные среды.
3.4. Реактивы и растворы.
3.5. Оборудование и приборы
3.6. Методы иммуноанализа
3.6.1. Непрямой твердофазный иммуноферментный анализ ТИФА
3.6.2. СэндвичТИФА
3.6.3. Догиммуноанализ
3.6.4. Иммуноблоттинг
3.6.5. Реакция двойной иммунодиффузии
3.7. Электрофорез
3.8. Лабораторные животные.
3.9. Методы статистического анализа
ГЛАВА 4. ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛИКЛОНАЛЬНЫХ
АНТИТЕЛ К КАПСУЛЬНОМУ АНТИГЕНУ И ЛПС
УСНОЬЕЯАЕ 0Ъ9
4.1. Выбор антигенов и оптимизация условий иммунизации животных
4.1.1. Получение антисывороток к ЛПС Ускоегсе .
4.1.2. Получение антисывороток к КАГ и цельным клеткам У.сИоегае
4.2. Иммунохимическая характеристика поликлональных антител к ЛПСТХУ, КАГ и цельным клеткам V. .
4.3. Получение и диагностическая значимость антител к липиду А V.
ГЛАВА 5. СОЗДАНИЕ ПАНЕЛИ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ОСОБЕННОСТЕЙ АНТИГЕННОЙ СТРУКТУРЫ КАПСУЛЬНЫХ И БЕСКАПСУЛЬНЫХ ФОРМ V.
5.1. Эффективность процедуры слияния и особенности скрининга позитивных клонов
5.2. Стабилизация гибридных линий и отбор I к отдельным эпитопам V.
5.2.1. Изучение опухолсродности клеточных линий
5.2.2. Особенности взаимодействия МКА с капсульными и бсскапсульнымн вариантами вибрионов серогруппы.
5.2.3. Влияние разных способов хранения на основные свойства гибридом
5.3. Применение МКА для изучения антигенной структуры вибрионов серогруппы
5.3.1. Общая характеристика лигандов, комплементарных МКА.
5.3.2. Молекулярная организация эпитопов, узнаваемых МКА, в препаратах антигенов, изолированных из капсульных и бсскапсульных форм V.
5.3.3. Изучение особенностей биосинтеза эпитопов, узнаваемых МКА, вибрионами серогруппы.
5.3.4. Идентификация и характеристика эпитопов со сходной специфичностью у близкородственных в антигенном отношении бактерий.
5.4. Изучение серологического родства структур адгезии некоторых возбудителей кишечных инфекций и холерного вибриона
ГЛАВА 6. КОНСТРУИРОВАНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ
ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ИММУНОФЕРМЕНТНЫХ ТЕСТСИСТЕМ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ V.
6.1. Поликлональные иммуноферментные тестсистемы.
6.2. Моноклональные иммуноферментные тестсистемы
ГЛАВА 7. ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ АНТИГЕНОВ ПРИ
МАСШТАБИРОВАННОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ У.СНОЬЕЯАЕ В ПРОЦЕССЕ ПРИГОТОВЛЕНИЯ
СООТВЕТСТВУЮЩЕЙ ХИМИЧЕСКОЙ ВАКЦИНЫ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА


А. Жидкова , проводя фракционирование ацетоновых препаратов штамма паратифозной папочки Бреслау фенолом, получали несколько эндотоксиновых фракций углеводнолнпоидного состава и белковые фракции микробной клетки. И И. Дубровской было обнаружено, что специфические вещества, извлеченные из бруцелл ТХУ, представляли собой два антигенных комплекса, один из которых состоял из полисахарида, липоида и белка, другой являлся комплексом полисахарида с нуклеиновыми кислотами и белком. В то же время выделенный методом горячей воднофенолыюй экстракции из ацетонвысушенных клеток штаммов ii и . ЛПС содержал белка, углеводов и некоторые другие примеси . С помощью методов . А.П. Коникова из вирулентных штаммов i i извлекали сложные пещества, представлявшие собой прочное соединение липидного и белкового компонентов с полисахаридом и нуклеопротсидами . М.Е. Изучение цсльноклеточных лизатов ii , лизатов, обработанных протеиназой К, и гомологичного ЛПС, выделенного по О. ЛПС стабильно ассоциирован с белками с м. I 3. Препарат, выделенный МН. Джапаридзе с соавт. V фракционированием сульфатом аммония супернатанта бульонной культуры и содержащий Оантигена, состоял из углеводов, белка и липидов. В нсдетоксицированном препарате Оантнгена холерного вибриона , выделенном ТХУ, присутствовали, наряду с углеводов, белка и другие примеси . Применяя ультрафильтрациоиную технологию, получали Оантиген того же возбудителя, представленный углеводами, белками, липидами и нуклеиновыми кислотами . Поскольку различные методы выделения эндотоксинов Оантигснов трудно сопоставимы, так как они используются на различных бактериальных моделях, А. Оантигена ТХУ, воднофеноловый, водный, водноэфирный, пиридинмуравьиной кислотой и цставлоном. Ни один метод не дал препаратов, свободных от пептидов, содержание аминокислот варьировало очень широко. Содержание углеводов и жирных кислот также различалось. Заслуживает внимания тот факт, что при выделении эндотоксина большинством методов из капсулообразующих штаммов наряду с ЛПС экстрагируется капсульное вещество. Так, при использовании мегода О. ЛИС, РНК и низкомолскулярные полисахариды. Этими полисахаридами, например, у . КАГ . Очищенный от нуклеинового компонента поверхностный антиген . М.Е. К и Оантигсны . Повидимому, это обусловило использование принципов экстракции ЛПС при выделении КАГ. Первым этапом выделения капсульной субстанции штамма . О9К была экстракция поверхностного полисахарида клетки горячим водным фенолом по методу . ДНКазой, РНКазой и протсиназой К с последующим ультрацентрифугированием и диализом для получения 1I 2. Для освобождения нативного капсульного материала штамма золотистого стафилококка от балластных веществ использовали обработку ТХУ, воднофеноловой смссыо, муравьинокислым буфером или смесью хлороформа и пбутанола с последующим осаждением полисахарида этанолом 7. Выделение КАГ ii i и i осуществляли также фракционированием сульфатом аммония ,6, 6. Необходимо отметить, что КПС и ЛПС имеют весьма существенные биохимические различия. Так, Ополисахаридная цепь ЛПС чаще бывает нейтральной и редко кислой, однако, как правило, концентрация отрицательного заряда не превышает одной кислотной группы на три моносахаридных остатка. Это отличает ЛПС КПС, преимущественно кислых, для которых характерна высокая концентрация огрицатсльного заряда , 3, 1. Кроме того, для всех i найдены различия в композиции сахаров ЛПС и КПС 9. Оантигена . Углеводный состав ЛПС и глнколипопротсина компонента слизи i также различен, что указывает на их нсидентичность . ЛПС и КАГ отличаются также по серологической специфичности. При нм. О и Кантигслы . Гликолипопротсин . ЛПС не только по химическим и физическим, но и по иммунологическим свойствам . Серологическая нсидентичность капсульных субстанций и соматического антигена выявлена также при получении антител к инкапсулированным и бескапсульным вариантам бактерий. Так, при иммунизации инкапсулированным штаммом . VV1 образовывались антитела к К, которые агглютинировали данный штамм, но не его нсинкапсулированный мутант 2.