Изучение биоразнообразия азотфиксирующих прокариот кислых торфяных почв на основе анализа последовательностей генов nifH

• Автор: Слободова, Наталья Валерьевна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 150 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗОВАННЫХ В РАБОТЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Почва как среда обитания микроорганизмов.

Глава 2. Методы исследования сообществ почвенных микроорганизмов

2.1. Традиционные микробиологические методы исследования

2.1.1. Методы иммунодиагностики

2.2. Молекулярные методы исследования сообществ. . . .

2.2.1. Определение ГЦ состава молекул ДНК

2.2.2. ДНК реассоциация

2.2.3. Методы на основе секвенирования нуклеиновых кислот
2.2.4. Методы молекулярного мониторинга сообществ на основе ПЦРанализа
2.2.4.1. ГГЕанализ,.
2.2.4.2. Молекулярный фингерпринтинг на основе рестриктазной обработки фрагментов.
2.2.4.3. Модификации ПЦРанализа со специфичными зондами и праймерами.
2.2.4.4. ПЦР со случайными праймерами
2.2.5. Методы, основанные на гибридизации нуклеиновых кислот.
2.3 Факторы, влияющие на точность молекулярных исследований . .
2.3.1. Выделение ДНК.
2.3.2. Ограничения ПЦР анализа.
2.3.3. Ограничения использовании ДГЕанализа.
2.3.4. Ограничения рестрикционного аналига.
2.3.5. Ограничения методов i i гибридизации
2.4. Системный подход в исследованиях микробных сообществ.
2.4.1. Анализ состава жирных кислот
2.4.2. Определение физиологического профиля сообщества i
2.4.3. Анализ проб со стабильными изотопами
2.4.4. Методы клонирования тотального генома сообщества
2.4.5. Анализ функциональных генов.
Глава 3. Разнообразие азотфиксирующих микроорганизмов
3.1. Значение биологической фиксации атмосферного азота
3.2. Строение и регуляция нитрогеназного комплекса.
3.3. Гены нитрогеназного комплекса.
3.4. Разнообразие азотфиксирующих микроорганизмов в природных экосистемах. .
3.5. Краткая характеристика аноксигенных фотосинтезирующих микроорганизмов
3.6. Некоторые аспекты проблемы фиксации азота в болотных экосистемах Заключение.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Объекты исследования
2. Получение препаратов ДНК
2.1. Получение препаратов ДНК из биомассы микроорганизмов
2.2 Получение препаратов ДНК из почвенных образцов.
2.2.1. Прямая экстракция нуклеиновых кислот из почвенных образцов
2.2.2. Получение препаратов ДНК из почвенных образцов через стадию выделения бактериальных клеток.
3. ПЦРамплификация
3.1. Амплификация генов рРНК.
3.2. ПЦР со специфичными праймерами к гену i .
4. Очистка фрагментов ПЦР в агарозе
5. Клонирование ПЦРфрагментов.
5.1. Приготовление компетентных клеток.
5.2. Лигирование.
5.3. Трансформация клеток плазм ид ной ДНК.
5.4. Селекция трансформированных колоний и выделение плазмидной ДНК.
5.5. Рестрикционный анализ плазмидной ДНК
6. Секвенирование
6.1. Меченые праймеров.
6.2. Постановка реакции секвенирования и форез.
7. Анализ полученных последовательностей.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1 Разработка экспрессметода выделения ДНК из почвенных образцов
1.1. Метод прямой экстракции нуклеиновых кислот из почвенного образца
1.2. Получение препаратов ДНК через стадию выделения фракции бактериальных клеток. . . . . .
2. Изучение последовательностей генов агН различных представителей
АНОКСИГЕННМХ ФОТОТРОФОВ И БЛИЗКИХ К НИМ МИКРООРГАНИЗМОВ
2.1. Выявление и анализ последовательностей фрагментов генов iу аиоксигенных фототрофных микроорганизмов. . .
2.2. анализ полученных последовательностей генов i.
3. Сравнение молекулярных, серологических и микроскопических методов для характеристики микробных сообществ
3.1. Микроскопический и серологический анализ.
3.2. Молекулярный анализ
4. Анализ диазотрофного сообщесгва кислой торфяной почвы сфагнового верхового болота
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Данный подход выявил огромное количество новых, не описанных ранее традиционными методами прокариот в окружающей среде Расе, . В последнее время было разработано много методов, обладающих высокой разрешающей способностью и позволяющих выявлять не только активные живые клетки, но и микроорганизмы, находящиеся в покоящихся формах. ДНК. Также в молекулярных исследованиях сообществ применяют методы, основанные на ДНК реассоциацин и на оценке ГЦсостава тотальной ДНК сообщества. Определение ГЦ состава молекул ДНК. Определение молярного процента суммы гуанина и цитозина к сумме молей всех четырех оснований в исследуемой ДНК является одним из классических генотипических методов. Содержание ГЦ видоспецифично и рассматривается как таксономический признак, который определяется для любого вновь описываемого микроорганизма. По содержанию ГЦ в ДНК бактерии очень сильно различаются между собой. Данная величина может варьировать в пределах от у некоторых стафилококков и представителей группы СуюрИаа до у представителей рода Мкгососст и некоторых миксобактерий, образующих плодовые тела. В молекулярной экологии оценивают изменения в ГЦ составе тотальной ДНК сообщества для детекции перемен в структуре данного сообщества. Однако использование этого метода сильно ограничено, так как о составе сообщества, численности его групп и других важных параметрах, он дает очень мало информации. ДНК реассоциацин. Метод, основанный на реассоциации ДНК, даст возможность оценивать уровень гомологии ДНК разных микроорганизмов. Чем ближе родство между исследуемыми организмами, тем выше уровень гомологии их последовательностей ДНК. На основе статистических данных по молекулярной гибридизации ДНК было сделано заключение о том, что представители одного вида прокариот должны иметь уровень гомологии ДНК не менее . В молекулярнобиологических исследованиях тотальную ДНК сообщества денатурируют, затем ренатурируют. Принцип кинетики ДИК ренатурации состоит в том, что скорость гибридизации прямо пропорциональна концентрации комплементарных последовательностей ДНК и обратно пропорциональна длине различных последовательное гей в образце ТЬегоп С1осе, 2ООО. Таким образом, по мере увеличения гетерогенности микробного сообщества скорость реассоциации ДНК, выделенного из этого сообщества, будет уменьшаться. Использование данного метода позволяет оценить тотальное генетическое разнообразие конкретного микробного сообщества ТогбуНс Оугсэб, . Однако применение его имеет некоторые технические ограничения для анализа требуется большое количество ДНК, высокой степени очистки. ДНК. Кроме того, этот подход не дает сведений о детальной структуре сообщества. Методы на основе секвенирования нуклеиновых кислот. С развитием технологии секвенирования нуклеиновых кислот появилась возможность использования данного подхода для исследования состава природных сообществ. Первоначально анализ разнообразия природных микробных популяций проводили на основе секвенирования генов 5 рРНК . Данный метод позволял исследовать небольшие микробные сообщества, включающие не более полутора десятков видов. Однако, он не нашел широкого распространения изза малой информативности этой молекулы при ее относительно высоком консерватизме. Позднее был предложен анализ генов рибосомной РНК . Международного Комитета по Систематике микроорганизмов , , последовательность гена рРНК должна быть определена для всех вновь описываемых видов бактерий. Кроме того, развитие техник клонирования ДНК и полимеразноцепной реакции ПЦР увеличило разрешающую способность данного метода для исследования более сложных сообществ. На основе анализа последовательностей генов рРНК группой ученых под руководством Везе , была предложена схема эволюции прокариот, которая отличалась от принятой ранее. Построение схемы основано на использовании коэффициента ассоциации который измеряет сходство последовательностей рРНК при попарном сравнении. Основной отличительной особенностью данной эволюционной схемы является разделение организмов на три царства эубактерии, архебактерии, эукариоты.