Дифференциация лептоспир различных экологических групп на основе гена, кодирующего липопротеин наружной мембраны LipL32

• Автор: Земская, Марина Сергеевна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 117 с. : ил.

1. Современная классификация и таксономия лсптоспир.

2. Экология лептоспир.

3. Строение генома лептоспир

4. Строение клеточной стенки и наружной мембраны лептоспир

5. Липопротеины наружной мембраны лептоспир

5.1. Основной белок наружной мембраны лептоспир i

5.2. i.
5.3. i.

6. Методы лабораторной диагностики лептоспирозов

6.1. Применение ПЦР в диагностике лептоспирозов.

7. Методы дифференциации патогенных лептоспир от сапрофитов.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Материалы
2.1.1. Штаммы микроорганизмов, препараты ДНК
2.1.2.Модельные образцы для определения чувствительности ЦР тест
системы.
2.1.3 .Клинический материал.
2.2. Методы.
2.2.1. Культивирование лептоспир
2.2.2. Определение концентрации лептоспир в счетной камере ПстроваХауссера
2.2.3.Техника постановки реакции микроагглютинации РМА при
л сптоспирозах
2.2.4. Полимеразная цепная реакция
2.2.4.1. Подготовка проб для ПЦРанализа чистых культур.
2.2.4.2. Приготовление модельных образцов для ПЦРанализа.
2.2.4.3. Приготовление и обработка проб для модельных систем
2.2.4.4. Приготовление суспензий из органов лабораторных животных
2.2.4.5. Подготовка образцов для ПЦРанализа
2.2.5. Праймеры для ПЦР.
2.2.6. Условия проведения ПЦР и регистрация результатов.
2.2.7. Определение аналитической чувствительности ПЦР тест
системы
2.2.8. Условия проведения ПЦР.
2.2.9.Статистическая обработка результатов
Глава 3. ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНА, КОДИРУЮЩЕГО ЛИПОПРОТЕИН НАРУЖНОЙ МЕМБРАНЫ ЛЕПТОСПИР i
3.1. Оли гону клсотиднмс последовательности праймеров.
3.2. Результаты исследования с праймерами. 0 4 и
6 0.
Глава 4. ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНА, КОДИРУЮЩЕГО ЛИПОПРОТЕИН НАРУЖНОЙ МЕМБРАНЫ ЛЕПТОСПИР i
4.1. Олигонуклеотидные последовательности праймеров.
4.2. Подбор оптимальных условий проведений ПЦР с праймерами .
4.3. Определение размера амплифицированного фрагмента ДНК.
4.4. Определение специфичности тест системы с использованием праймеров и .
4.5. Определение аналитической чувствительности тестсистемы
4.6. Результаты ПЦР с использованием праймеров и .
4.6.1. Специфичность тест системы с использованием праймеров и
.
4.6.2.0пределение аналитической чувствительности тестсистемы.
4.6.3. Определение размера амплифицированного фрагмента ДНК.
4.7. вариант ПЦР тестсистемы
4.7.1. Определение размера амплифицированного фрагмента ДНК
4.7.2.Снецифичность тест системы.
4.7.3. Определение аналитической чувствительности тестсистемы.
4.8.Определение распространенности гена, кодирующего Ыр2, у
представителей различных таксономических групп.
Глава 5. ИССЛЕДОВАНИЕ МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМ И КЛИНИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ С ПОМОЩЬЮ ТЕСТСИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ ГЕНА, КОДИРУЮЩЕГО ЛИПОПРОТЕИН НАРУЖНОЙ МЕМБРАНЫ
ЛЕПТОСПИР 1лрЬ.
5.1. Модельные образцы.
5.1.1 .Специфичность тестсистемы
5.1.2. Определение размера амплифицированного фрагмента ДНК
5.1.3. Определение аналитической чувствительности
5.2. Исследование клинических образцов сыворотки.
5.2.1.Исследование сывороток крови больных во время вспышки лептоспироза в Краснодарском крае в г
5.2.2.Исследование сывороток крови больных во время вспышки лептоспироза в Краснодарском крае в г
6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
7. ВЫВОДЫ.
8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ВВЕДЕНИЕ


Международным подкомитетом по таксономии лептоспир , Осака, альтернативная система их видовой дифференциации, в соответствии с которой выделено геномных видов. Очевидно, что включение последних в панели эталонов для реакции микроагглютинации РМА золотой стандарт значительно снижает достоверность лабораторной диагностики лептоспирозов людей и животных. Таким образом, новый подход к классификации и таксономии, основанный на произвольных количественных критериях, i подкрепленных фенотипическими и экологическими характеристиками таксонов, поставил и новую проблему разработку надежных методов генетической демаркации основных экологических групп лептоспир. В последние годы в практику молекулярногенетических научных и диагностических исследований вошел метод секвенирования ДНК для ряда бактерий, в том числе и лептоспир 8, 8, 2,секвенированы полные геномы. Знание полногеномных последовательностей и информативность их сравнительного анализа позволяет найти новые подходы к решению многих проблем общей и медицинской микробиологии, а так же выявлять частные особенности геномов отдельных микроорганизмов, например, связанных с патогенностью и др. Однако получение исчерпывающей информации о вариабельности геномов, которая необходима для однозначной идентификации не просто видов, а штаммов и изолятов бактерий, с помощью прямого секвенирования практически нереальна изза чрезвычайной вариабельности микроорганизмов и наличии генов, функции которых неизвестны. Кроме того, наличие сиквснсов полных геномов в ряде случаев является, как бы избыточной информацией в научной и практической работе, например, при анализе определенных генов и диагностике возбудителей инфекций. Поэтому встает вопрос о развитии несеквенирующих методов анализа геномов, в которых можно использовать уже секвенированные геномы в качестве стандартного сравнения 1. I или требует подбора маркерных генов. Для многих микроорганизмов, в том числе и для лептоспир, не существует рекомендаций, какие гены можно использовать в качестве маркерных. Представляется целесообразным анализ возможности применния генов белков внешней мембраны в качестве маркерных, так как поверхностная структура бактериальной клетки по своей локализации занимает пограничное положение i между клеткой и окружающей средой. Для многих грамотрицательных бактерий показана ведущая роль полиморфизма белков внешней мембраны в обеспечении патогенности и других свойств. К моменту начала наших исследований у патогенных лептоспир были обнаружены белки наружной мембраны с различным уровнем экспрессии i vi и i viv, отсутствующие у сапрофитов , , 6. Последнее дало основание предположить их важную роль в этиопатогенезе лептоспирозной инфекции. Установлена также его иммуногенность и связь с продукцией гемолизина одного из факторов патогенности лептоспир 7. Разработка метода дифференциации свободноживущих и паразитических лептоспир на основе детекции генов, кодирующих синтез липопротеинов внешней мембраны. На основе нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих липопротеины внешней мембраны i и i, разработать тестсистемы ПЦР для индикации лептоспир. На основании полученных данных провести анализ современных таксономических схем лсптоспир. На модельных системах биологический материал от людей и экспериментальных животных, вода, почва изучить возможность применения разработанной тестсистсмы для индикации патогенных лсптоспир в объектах внешней среды, а также в организме людей и животных. Оценить парамезры диагностической эффективности ПЦР тестсистемы на основе гена, кодирующего липопротеин наружной мембраны лептоспир 1лрЬ, на клиническом материале, полученном в очагах лептоспирозной инфекции. Впервые на репрезентативной выборке штаммов в их числе паразитических и сапрофитных различных надвидовых и подвидовых таксонов, изучена распространенность гена, кодирующего липопротеин наружной мембраны лептоспир 1лрЬ. С этой целью на основе нуклеотидных последовательностей фрагментов гена размером 7 и 4 п. Ь основного белка наружной мембраны разработана ПЦР тестсистема в том числе пез1сс1вариант. Ь.Ы1еха, Ьлуо1Ъаски и др.