Выявление и филогенетический анализ генов, кодирующих большую субъединицу рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы формы I, у бактерий различных таксономических групп

• Автор: Спиридонова, Елизавета Михайловна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 127 с. : ил.

Введение.

Обзор литературы

Глава 1. Пути автотрофной ассимиляции СО2.

1.1. Восстановительный рибулозобисфосфатный цикл.

1.2. Восстановительный цикл трикарбоновых кислот.

1.3. 3гидроксипропионатный цикл и восстановительный цикл дикарбоновых кислот

1.4. Нециклические системы автотрофной ассимиляции СО2.

Глава 2. Формы РБФК.

2.1. Форма 1.

2.2. Форма II

2.3. РБФК архей форма III

2.4. РБФКподобные белки форма IV
2.5. Локализация и организация генов, кодирующих РБФК
Глава 3. Филогения и эволюция РБФК
3.1. Сопоставление филогении РБФК с пластиднои и протеобактсриалыюн филогенией
3.2. Горизонтальный перенос генов, кодирующих РБФК.
3.3. Дупликация и дифференциальная потеря гена.
Глава 4. Изучение биоразнообразия природных сообществ.
4.1. Молекулярнобиологические методы изучения микробных сообществ
4.2. Использование генов, детерминирующих автотрофию, для анализа природных экосистем.
Экспериментальная часть.
Глава 5. Материалы и методы.
5.1. Объекты исследования3
5.2. Выделение ДНК.
5.3. Выбор праймеров
5.4. Амплификация фрагментов исследуемых генов
5.4.1. Амплификация фрагментов генов, кодирующих РБФК формы
5.4.2. Амплификация фрагментов генов, кодирующих Б рРНК
5.4.3. Амплификация фрагментов генов, кодирующих метанмонооксигеназу.
5.5. Детектирование продуктов ПЦР.
5.6. Очистка ПЦРфрагментов.
5.7. Клонирование ПЦРфрагментов
5.7.1. Приготовление компетентных клеток
5.7.2. Лигирование
5.7.3. Трансформация клеток плазмидной ДНК
5.7.4. Выделение плазмидной ДНК.
5.8. Секвснироваиие ДНК.
5.9. Филогенетический анализ исследуемых последовательностей
5 Депонирование нуклеотидных последовательностей
Результаты и обсуждение
Глава 6. Разработка и проверка системы олигонуклеотидных праймеров для амплификации фраментов генов, кодирующих РБФК формы I, у бактерий различных таксономических групп
6.1. Разработка системы олигонуклеотидных праймеров для амплификации фрагментов генов, кодирующих РБФК формы I, у бактерий различных таксономических групп
6.2. Проверка разработанной системы праймеров на автотрофных бактериях с известной первичной структурой генов, кодирующих РБФК формы 1.
6.3. Оптимизация условий ПЦР для амплификации фрагментов генов, кодирующих РБФК формы
Глава 7. Филогенетический анализ генов у представителей различных таксонов прокариот
7.1. Выявление, секвенирование и филогенетический анализ генов у фотолитоавтотрофных бактерий семейства ii
7.2. Выявление, секвенирование и филогенетический анализ генов у хемолитоавтотрофных бактерий
7.2.1. р. ii
7.2.2. р. iivii и iii
7.2.3. р. iiii и iii
7.2.4. р. iv.
Глава 8. Определение разнообразия эндосимбиотического сообщества моллюска i i.
Список литературы.
ВВЕДЕНИЕ


К первым относятся восстановительный рибулозобисфосфатный цикл цикл Кальвина, восстановительный цикл трикарбоновых кислот, 3гидроксипропионатный цикл и восстановительный цикл дикарбоновых кислот. Незамкнутые системы обнаружены у некоторых ацетогенных, метанобразующих и сульфатредуцирующих бактерий цит. Кондратьева, . Наиболее распространенным путем автотрофной ассимиляции СО2 является цикл Кальвина ВазБЬат а. СаЬпп, . По этому пути осуществляется фиксация углекислоты у высших растений, водорослей, цианобактерий, пурпурных бактерий и многих хемолитоавтотрофов. Ключевыми ферментами данного цикла являются рибулозо1,5бисфосфаткарбоксилазаоксигеназа РБФК и фосфорибулокиназа. РБФК катализирует присоединение атома углерода атмосферного СО2 к пятиуглеродному сахару рибулозо1,5бисфосфату, что приводит к образованию нестабильного шестиуглеродного соединения, которое немедленно распадается на две молекулы 3фосфоглицериновой кислоты. Затем происходит восстановление полученного продукта до уровня триозофосфатов и регенерация акцептора СО2 в процессе дальнейших молекулярных перестроек. В результате фиксации трх молекул СО2 на трх молекулах рибулозо1,5бисфосфата синтезируется одна молекула фосфоглицерата, которая в итоге используется для образования органического материала клетки Рис. Рис. Рибулозобисфосфатный цикл ассимиляции СОг цит. Кондратьева, . Кроме карбоксилирования, РБФК при наличии кислорода может осуществлять оксигеназную реакцию расщепления рнбулозобисфосфата на фосфогликолевую и фосфоглицериновую кислоты Воуе е1 а1. Земле. Реакция оксигенирования является результатом появления кислорода в атмосфере в процессе деятельности оксигенных фототрофов. Особый циклический процесс ассимиляции СОг существует у зеленых серобактерий, некоторых водородных бактерий и ряда сульфатредукторов и представляет собой модифицированный цикл Кребса, действующий в обратном направлении. Этот путь получил название восстановительного цикла трикарбоновых кислот ВЦТК Рис. За один оборот ВЦТК происходит фиксация двух молекул СО2 на сукцинилКоА при участии ферредоксинзависимой акетоглутаратсинтазы и на акетоглутарате в результате действия изоцитратдегидрогеназы. Одним из ключевых ферментов этого цикла является АТФзависимая цитратлиаза, катализирующая разложение цитрата с образованием ацетилКоА и оксалоацетата Ivv . АцетилКоА также может карбоксилироваться при участии пируватсинтазы с образованием пирувата. Из пирувата образуется фосфоенолпируват, при карбоксилировании которого образуется оксалоацетат, одно из соединений ВЦТК. Таким образом, этот цикл может дополняться фиксацией еще двух молекул СО2 Ivv . И, следовательно, очень чувствительны К С2, что делает возможным функционирование цикла только в анаэробных условиях. Рис. Восстановительный цикл трикарбоновых кислоту СЫогоЫит ii iiii цит. Кондратьева, . Автотрофная ассимиляция углекислоты у зеленой несерной бактерии x i происходит циклическим путем, существующим в двух вариантах. Автотрофная фиксация СО2 у I i ОК, выделенного из горячих источников штата Орегон США, происходит при участии 3гидроксипропионатного цикла Рис. Главными карбоксилирующими ферментами являются ацетилКоАкарбоксилаза и пропионилКоАкарбоксилаза. Происходит фиксация СО2 на ацетилКоА с образованием малонилКоА. В результате последующих реакций малонилКоА превращается в 3гидроксипропионат, а из него образуется пропионилКоА, который также служит акцептором углекислоты. Это ведет к синтезу метилмалонилКоА, метаболизм которого приводит к образованию малата. Малат превращается в малилКоА, который расщепляется с образованием ацетилКоА, возвращающегося в цикл, и глиоксилата как продукта фиксации двух молекул СО2 . КоА
метилмалонилКоА
лропионилКоА
Рис. С1, аигстпаст ОК цит. Кондратьева, . Предполагается, что 3гидроксипропионатный цикл функционирует у ряда аэробных автотрофных архей представителей семейства 8и1о1оЬасеае Ме1ао5ркаега Би1о1оЬш тМаШсш, АЫсИапш тегпш, Ас. Ыхсйею, Ас. ЬпегкуС, у которых обнаружены некоторые ферменты данного цикла Ыш е а1. Мепепбег е1 а1. Нег е1 а. Рис. Восстановительный цикл дикарбоновых кислот у С1, аигапйасш В3 цит. Кондратьева, .