Генетическое конструирование штаммов - продуцентов протективного антигена Bacillus anthracis

• Автор: Кудрявцева, Ольга Михайловна
• Шифр специальности: 03.00.07, 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 133 с. : ил.

Оглавление
ВВЕДЕНИЕ

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Генетическая организация i i

1.2. Создание рекомбинантных штаммовпродуцентов протективного антигена сибиреязвенного микроба

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Штаммы микроорганизмов, использованные в работе

2.2. Питательные среды, реактивы и лабораторные животные

2.3. Методики

2.3.1. Элиминация плазмид
2.3.2. Определение протеолитической активности
2.3.3. Выделение плазмидных ДНК штаммов В. i и i ii
2.3.4. Рестрикция ДНК плазмид
2.3.5. Конструирование гибридной плазмиды с клонированым геном сибиреязвенного микроба
2.3.6. Трансформация штаммов В. i и В. ii
2.3.7. Метод полимеразной цепной реакции
2.3.8. Исследование белкового состава культуральных фильтратов
2.3.9. Выделение протективного антигена из рекомбинантного штамма В. i
2.3 Получение иммунных сывороток и специфических антител к протективному антигену
2.3 Реакция радиальной диффузной преципитации на средах с сибиреязвенным углобулином или антиПА антителами
2.3 Реакция иммуноблота
2.3 Дотиммуноанализ
2.3 Метод непрямого твердофазного иммуноферментного анализа
2.3 Определение титра антител к протективному антигену у иммунизированных животных
2.3 Определение стабильности плазмид i vi и i viv
2.3 Приготовление споровой взвеси и определение количества живых спор рекомбинантных и вакцинных штаммов
2.3 Определение ЛД5о бациллярных штаммов для линейных мышей
2.3 Определение иммуногенности рекомбинантных штаммов
ГЛАВА 3. КОНСТРУИРОВАНИЕ ШТАММОВ, СОДЕРЖАЩИХ КЛОНИРОВАННЫЙ ГЕН СИНТЕЗА ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕНА СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА
3.1. Подбор оптимальных донорных и реципиентных штаммов для генетического конструирования продуцентов протективного антигена
3.2. Оптимизация трансформационной передачи плазмидной ДНК в клетки В. i и В. ii
3.3. Определение возможности селекции рекомбинантных клонов, синтезирующих протективный антиген на среде с сибиреязвенным углобулином
3.4. Конструирование гибридных плазмид, содержащих ген синтеза протективного антигена
ГЛАВА 4. ПОЛУЧЕНИЕ И ОТБОР СТАБИЛЬНЫХ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВРОДУЦЕНТОВ ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕНА
4.1. Передача гибридной плазмиды РЛ1 в бесплазмидные бациллярные штаммы
4.2. Определение уровней продукции ПА рекомбинатными штаммами на основании иммунохимических методов исследования
4.3. Определение стабильности рекомбинантных штаммов i vi и i viv
ГЛАВА 5. ОЦЕНКА ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ
5.1. Подбор оптимальной иммунизирующей дозы для лабораторных животных
5.2. Сравнительное изучение индексов иммунитета сконструированных штаммовпродуцентов протективного антигена и вакцинных культур
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ


Гибридные плазмиды с делениями в области получены В. Ivi и . Отечественными авторами также предпринимались попытки клонирования гена в гетерологичных системах в вакцинных штаммах i i Павлов В. Тедиков В. Кисличкина О. Алимов А. Павлов В. В. ii, Тедиков В. ПА, так и эффективные рекомбинантные продуценты ПА. Таким образом, все вышеизложенное определяет актуальность планируемой диссертационной работы. Цель диссертационной работы генноинженерное конструирование эффективных и стабильных штаммовпродуцентов протективного антигена сибиреязвенного микроба. Микробиологический анализ реципиентных и донорных штаммов для создания продуцентов протективного антигена оптимизация метода трансформационной передачи гибридной ДНК в клетки В. В. ii поиск возможных способов селекции трансформантов, продуцирующих протективный антиген. Конструирование гибридных плазмид, содержащих ген синтеза протективного антигена клонирование гена в гомо и гетерологичных бациллярных штаммах. Получение и отбор рекомбинантных штаммов с высокой продукцией протективного антигена сибиреязвенного микроба. Изучение стабильности генноинженерных штаммовпродуцентов протективного антигена i vi и i viv. Сравнение уровней продукции протективного антигена рекомбинантными и вакцинными штаммами сибиреязвенного микроба с использованием биохимических и иммунохимических методов исследования. Изучение иммуногенных свойств сконструированных штаммов с клонированным геном на модели лабораторных животных. Научная новизна исследования. Впервые на основе бесплазмидных производных отечественных вакцинных штаммов В. СТИ1 и В. Сконструирована гибридная плазмида 1, содержащая ген , стабильно функционирующая в составе бациллярных штаммов и обеспечивающая высокий уровень продукции протективного антигена сибиреязвенного микроба. Рекомбинантные штаммы В. СТИДТПА1, В. ДТПА1 и В. В0ДТПА1 стабильны при пассировании i vi и i viv, обладают низкой активностью протеолитических ферментов и пятикратно превосходят вакцинные штаммы В. СТИ1 и В. В экспериментах на морских свинках и линейных мышах показано, что рекомбинантные штаммы В. СТИДТПА1 и В. ТПА1, содержащие гибридную плазмиду I ЮРА1, обладают протективным эффектом, обеспечивая защиту лабораторных животных на уровне вакцинного штамма В. СТИ1. В Роспатент подана заявка на патентование рекомбинантного штамма В. Практическая ценность. В Государственной коллекции патогенных бактерий Микроб депонированы рекомбинантные штаммы В. КМ В. ДТПА1, В. КМ В. СТИДТПА1 и В. КМ 9 В. II1. Штаммы содержат гибридный репликон 1 ЮРА1, несущий ген . Штаммы В. ДТП А1, В. СТИДТПА1 и В. I являются безопасными, стабильными и эффективными продуцентами протективного антигена сибиреязвенного микроба основного компонента химических сибиреязвенных вакцин и диагностических препаратов. В Государственной коллекции патогенных бактерий Микроб депонированы изогенные штаммы В. КМ2 В. ДТ бесплазмидный производный вакцинного штамма В. В. i КМ3 В. В. i . Штаммы предназначены для использования в качестве реципиентов при осуществлении клонирования детерминантов иммуногенности сибиреязвенного микроба. По материалам диссертации составлены методические рекомендации Комплекс методических подходов к определению продукции протективного антигена сибиреязвенного микроба, одобренные Ученым советом РосНИПЧИ Микроб протокол Ученого совета РосНИПЧИ Микроб 2 от г. РосНИПЧИ Микроб. Материалы диссертации используются в лекциях по генетике бактерий на курсах специализации и повышения квалификации врачей и биологов по особо опасным инфекциям при РосНИПЧИ Микроб. На основе протеазодефицитных бесплазмидных производных В. СТИДТ, В. ДТ и В. Рекомбинантные штаммы В. СТИДТПА1, В. ДТГ1А1 и В. МВбООПА1 содержат гибридный репликон ЮРА1 6,5 т. Сконструированные штаммы В. СТИДТПА1, В. ДТПА1 и В. В. i СТИ1 и В. Рекомбинантные штаммы В. СТИДТПА1, В. ДТПА1 и В. Гибридная плазмида 0i стабильно функциониует в составе бациллярных штаммов в условиях селективного давления, а также при чередовании пассажей на селективных и обычных средах. Генноинженерные штаммы В. СТИДТИА1 и В.