Аспорогенный рекомбинантный штамм Bacillus anthracis – продуцент протективного антигена сибиреязвенного микроба

• Автор: Шулепов, Дмитрий Викторович
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 109 с. : 15 ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. В. аМИгаЫБ возбудитель сибирской язвы

1.2. Сибиреязвенный токсин структура, механизм действия, функции и генетическая детерминация
1.3. Выделение протективного антигена из культуральных фильтратов аггенуированных и рекомбинантных штаммов и его практическое использование

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Штаммы микроорганизмов, бактериофаги и плазмиды, использованные в работе

2.2. Питательные среды, реактивы и лабораторные животные

2.3. Методы исследования
2.3.1. Определение видовых признаков В. апШгаЫя
2.3.2. Определение протеолитической активности штаммов В.
апШгаая
2.3.3. Определение способности сибиреязвенных культур к
споруляции
2.3.4. Определение стабильности свойства аспорогенности
2.3.5. Приготовление споровой взвеси
2.3.6. Определение ЛДзо штаммов В. амВгааз для лабораторных животных
2.3.7. Определение протективных свойств рекомбинантного
протективного антигена
2.3.8. Трансформация штаммов В. аМИгасгэ
2.3.9. Выделение плазмидных ДНК штаммов В. апгИгася
2.3 Определение стабильности гибридных плазмид т уНго
2.3 Метод полимеразной цепной реакции
2.3 Исследование белкового состава культуральных фильтратов
2.3 Выделение и очистка протективного антигена из культу
рального фильтрата рекомбинантного штамма В. ii
2.3 Определение концентрации белка в препаратах
2.3 Получение иммунных сывороток и специфических антител к протективному антигену
2.3 Реакция радиальной диффузной преципитации на срсдс
с антиПА антителами 4
2.3 Постановка иммуноблот анализа с поликлональными антителами к протективному антигену
2.3 Постановка дотиммуноанализа с поликлональными антителами к протективному антигену
2.3 Твердофазный иммупоферментный анализ
2.3 Количественная оценка продукции протективного анти
гена рекомбинантными и вакцинными штаммами В. i
2.3 Статистические методы
ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ АСПОРОГЕННОГО РЕКОМБИНАНТНОГО ШТАММАПРОДУЦЕНТА ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕНА СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА
3.1. Генетическое конструирование аспорогенного штаммапродуцента протективного антигена
3.2. Стабильность репликации гибридной плазмиды ЮРА1 в аспорогенных трансформантах
3.3. Определение уровней продукции протективного антигена аспорогенными и спорообразующими клонами с
рЦВПОРА1
3.4. Изучение стабильности биологических свойств аспорогенного штаммапродуцента протективного антигена при пассировании на питательных средах и хранении
ГЛАВА 4. ВЫДЕЛЕНИЕ ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕНА ИЗ КУЛЬТУРАЛЬНОГО ФИЛЬТРАТА РЕКОМБИНАНТНОГО АСПОРОГЕННОГО ШТАММА В. АШНПАСК И ХРОМАТОГРАФИЧЕСКАЯ ОЧИСТКА ПРЕПАРАТА
4.1. Оптимизация условий культивирования аспорогенного продуцента протективного антигена
4.2. Разработка экспериментальной схемы выделения и очистки протективного антигена из культурального фильтрата рекомбинантного штамма
ГЛАВА 5. ХАРАКТЕРИСТИКА И ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕНА, ПОЛУЧЕННОГО ИЗ СКОНСТРУИРОВАННОГО ПРОДУЦЕНТА В. АтНЯАСЮ АТПА1 БРО
5.1. Характеристика препарата протективного антигена, выделенного из культурального фильтрата аспорогенного рекомбинантного продуцента
5.2. Получение специфичных антител к рекомбинантному протективному антигену
5.3. Использование рекомбинантного протективного антигена
и антител к нему в иммунохимических реакциях
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ


По данным медицинских наблюдений в США у людей, вакцинированных против сибирской язвы, наблюдаются локальные реакции в виде аллергических проявлений или даже некроза тканей i В. Е., . Токсическое действие бесклсточных препаратов связывают, прежде всего, с содержанием в них примесей ОФ и ЛФ, а также некоторых других продуктов жизнедеятельности клеток. Еще одной проблемой промышленного получения ПА является его выраженная деградация на этапах выделения и очистки, что связано с высокой активностью протеолитических ферментов большинства культур В. С развитием генноинженерных технологий стало возможным получение рекомбинантных штаммов, продуцирующих только один компонент токсина ПА. Известно много прецедентов клонирования детерминанты синтеза ПА в штаммах различных видов бактерий, а также в геномах вирусов и трансгенных растений Тедиков В. М., Добрица А. П., Алимов А. П., Павлов В. М., Дармов И. В. с соавт. Vi М. Ivi В. I . V. . Однако далеко не во всех случаях авторам удалось добиться стабильного функционирования гибридных плазмид в гетерологичных системах. Проблематичным оказалось и достижение достаточно высокого уровня продукции . Ранее в лаборатории прикладной генетики РосНИПЧИ Микроб были созданы генноинженерные штаммы, продуцирующие ПА Микшис Н. И. с соавт. Посредством встраивания участка X, содержащего ген , детерминирующий синтез Г1А сибиреязвенного микроба, в мультикопийный вектор по сайтам рестрикции была сконструирована гибридная плазмида и селектирован ее делеционный вариант I1. Плазмида стабильно функционировала в геномах бациллярных штаммов В. СТИАТ, В. АТ и В. ПА на уровне до 0 мкгмл, что в несколько раз превышает секретируемый синтез данного белкового продукта, зарегистрированный для вакцинных штаммов В. С позиций биологической и экологической безопасности в промышленном производстве химических сибиреязвенных вакцин предпочтительнее использование штаммовпродуцентов, не образующих спор. Анализируя отечественный и зарубежный опыт создания бациллярных продуцентов ПА, выявили лишь единичные случаи получения их аспорогенных вариантов. Самой перспективной оказалась конструкция на основе рекомбинантного штамма В. М., . Хотя селектированный в его популяции спонтанный аспорогенный мутант отличался выраженной протеолитической активностью, добиться приемлемого выхода очищенного ПА мкгмл удалось за счет коррекции условий его культивирования . В США зарегистрирован патент на метод приготовления химической вакцины на основе ПА, продуцируемого аспорогениым штаммом В. Ivi В. Отечественных аналогов продуцентов для безопасной и экологичной технологии выделения ПА не существует. В. i и оценка его в качестве продуцента протективного антигена сибиреязвенного микроба. Получить рекомбинантный штамм с клонированным геном являющийся продуцентом протективного антигена сибиреязвенного микроба и характеризующийся отсутствием способности к образованию спор. Оценить стабильность биологических свойств аспорогенного рекомбинантного штаммапродуцеита в условиях хранения и при культивировании на питательных средах. Провести оценку уровня продукции протективного антигена сконструированного штамма, сравнить с уровнями продукции вакцинных культур. Оптимизировать условия культивирования аспорогенного рекомбинантного штамма, разработать экспериментальную схему выделения и хроматографической очистки протекгивного антигена из его культурального фильтрата. Получить высокоочищенный препарат рекомбинантного протективного антигена, осуществить его биохимическую и иммунохимическую характеристику. В экспериментах i viv показать перспективность использования рекомбинантного протективного антигена в создании профилактических сибиреязвенных препаратов. Получить поликлональные антитела к рекомбинантному ПА и оценить возможность их применения для постановки иммунохимических реакций. Впервые на основе бесплазмидного производного отечественного вакцинного штамма В. Штамм стабильно наследует гибридный репликон 1 и не реверсирует к спорообразующему фенотипу. Сконструированный штамм не содержит гены, детерминирующие синтез факторов вирулентности В.