Миколитические ферменты бактерий Bacillus Cohn и их роль в антагонизме к почвенным микромицетам

• Автор: Широков, Алексей Валерьевич
• Шифр специальности: 03.00.07, 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Уфа
• Количество страниц: 149 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Миколитическая активность сапротрофных почвенных бактерий как одно из проявлений антагонизма к мицелиальным грибам

1.2. Природа ми колитической активности и строение клеточной стенки грибов

1.3. Характеристика миколитических ферментов бактерий и данные

об их роли в антагонизме к почвенным микромицетам.

1.3.1.Ферменты, гидролизующие хитин и хитозан.

1.3.2. р1,3глюканазы и родственные ферменты.

1.3.3. Ферменты, гидролизующие компоненты матрикса клеточной стенки грибов.

1.4. Сравнительная оценка роли ферментов и метаболитов бактерий
i в механизмах лизиса и подавления роста микромицетов.
1.5 Перспективы применения миколитических ферментов
i в защите растений от болезней и других областях
2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Бактериальные культуры.
2.2. Культуры грибов
2.3. Физикохимические методы.
2.3.1. Получение коллоидного хитина
2.3.2.Получение коллоидного хитозана.
2.3.3.Получение других источников углерода.
2.4. Определение антигрибной активности бацилл в смешанной
культуре с фитопатогенными и сапротрофными грибами.
2.5. Оценка антигрибной активности ферментов и метаболитов
бактерий i .
2.6. Методы измерения активности миколитических ферментов
2.6.1. Определение общей миколитической активности
2.6.2. Определение хитиназной активности
2.6.3. Определение хитозаназной активности
2.6.4. Определение Р1,3глюканазной ламинариназной активности
2.6.5. Определение общей протеазной активности
2.7. Оценка литического воздействия ферментов бактерий i
на клеточные стенки и интактный мицелий микромицетов
2.8. Микроскопия.
2.9. Методы выделения и очистки миколитических ферментов.
2.9.1. Осаждение сульфатом аммония
2.9.2. Анионообменная хроматография на ДЭАЭносителях
2.9.3. Аффинная адсорбция на коллоидном хитине
2.9.4. Хроматография на тойоперле .
2.9.5. Гельэлектрофорез в денатурирующих условиях
2 Методы выделения, очистки и идентификации
метаболитов с антигрибной активностью.
. Ультрафильтрация
. Осаждение ацетоном.
. Хроматография на бумаге и в тонком слое.
. Гельхроматография на тойоперле .
. Аминокислотный анализ.
2 Определение концентрации белка.
2 Статистическая обработка результатов.
ОТБОР ПРОДУЦЕНТОВ МИКОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ ИЗ КОЛЛЕКЦИИ БАЦИЛЛАНТАГОНИСТОВ И ИССЛЕДОВАНИЕ ИХ МИКО
ЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ.
3.1. Основные критерии отбора штаммов
3.2. Действие отобранных штаммов бациллантагонистов и их
метаболитов на рост и развитие ii ii в смешанной жидкой культуре.
3.3. Синтез миколитических ферментов бактериямиантагонистами
в совместной культуре с микромицетами.
3.4. Миколитическая и фунгистатическая активность внеклеточных
метаболитов бактерий i .
4. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОСНОВНЫХ МИКОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ АНТАГОНИСТИЧЕСКИХ ШТАММОВ БАКТЕРИЙ 1
4.1. Характеристика отобранных штаммов i по уровню
и спектру синтезируемых ферментов.
4.2. Изучение взаимосвязи между миколитической активностью и синтезом внеклеточных ферментов у бациллантагонистов
4.3. Особенности выделения и очистки миколитических ферментов
4.3.1. Хитиназа.
4.3.2. Хитозаназа.
4.3.3. р1,3глюканаза ламинариназа
4.3.4. Общая протеазная активность бактерийантагонистов
4.4. Характеристика основных физикохимических и каталитических свойств миколитических ферментов ряда бактерий i
4.5. Сравнительная характеристика миколитической активности бациллярного ферментного комплекса и его индивидуальных компонентов.
4.6. Взаимодействие миколитических ферментов бациллантагонистов
при гидролизе клеточных стенок микромицетов
5. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МИКОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ И ВТОРИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ БАЦИЛЛ АНТАГОНИСТОВ ПОЧВЕННЫХ МИКРОМИЦЕТОВ
5.1. Общая характеристика антигрибных веществ, продуцируемых
штаммами бациллантагонистов.
5.2. Выделение и свойства низкомолекулярных метаболитов бактерий
i .
5.3. Антигрибная активность миколитических ферментов бацилл
5.4. Взаимодействие миколитических ферментов и вторичных
метаболитов антибиотической природы.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
ВВЕДЕНИЕ
В разработке современных методов биологической борьбы с фитопатогенными грибами большое значение имеют исследования процессов микробного антагонизма. Среди почвенных бактерийантагонистов перспективными агентами биологического контроля фитопатогенов являются бактерии i . Бациллы широко распространены в почве и обладают такими преимуществами, как легкость выделения, быстрый рост на относительно простых питательных средах, возможность культивирования в промышленных масштабах для получения биомассы, ферментов, биологически активных веществ и других технологических препаратов.
Актуальность


НАГАз или С1сЫАсз И, ЫтриацетилР0хитотриоза
1. Лизис различных микромицетов почвенными бактериями был описан еще в х гг. Я.П. Худяков, . Именно тогда было положено начало исследованиям данного явления, как одного из типов антагонистических взаимоотношений между микроорганизмами, который может успешно применяться для защиты сельскохозяйственных растений от фитопатогенных грибов Д. М. Новогрудский, . До этого времени внимание на лизис грибов под действием бактерий обращали в основном микологи в связи с проблемой бактериального заражения чистых культур в условиях лаборатории , . Позднее различными исследователями была подтверждена возможность успешного применения почвенных миколитических бактерий для защиты различных сельскохозяйственных культур от болезней, вызываемых грибами vi, , I. I, i, , . Уже на начальном этапе исследований ученые указывали на различные случаи антагонистических взаимоотношений между грибами и бактериями, разделяя такие явления как лизис и угнетение развития одного микроорганизма другим , , Я. П. Худяков, . Современные взгляды на антагонизм к микромицетам и различные варианты его проявления сформировались в е гг. При конкуренции за источники углерода и энергии, быстро растущие микроорганизмы интенсивнее потребляют субстрат, ограничивая тем самым рост других, нуждающихся в тех же источниках питания. Образование при этом токсичных веществ неспецифического действия, например органических кислот, микробных ядов производные синильной кислоты, летучих соединений аммиак и др. В антагонизме бактерий i к микромицетам доминирующая роль, по всей видимости, принадлежит соединениям антибиотической природы, число которых к настоящему времени превышает 0. Угнетение роста грибов без видимого изменения в их структуре, свойственное действию многих штаммовантагонистов, зачастую не характерно для бацилл, активно лизирующих мицелиальные грибы. Такие штаммы рассматриваются как типично миколитические . М. x, , Ю. М. Возняковская, А. К Труфанова, . В свое время, рассматривая различные проявления грибного антагонизма, некоторые исследователи большее значение придавали антибиотическим веществам, продуцируемым микробамиантагонистами . Г.С. Муромцев, И. И. Черняева, , другие считали главным условием в борьбе за выживаемость фитопатогенов в почве конкуренцию за питательные вещества , Т. Г. Мирчинк, Марфенина, , . Позднее были получены результаты, показывающие, что проявление различных типов антагонистических взаимоотношений определяется внешними факторами, в первую очередь количеством доступных питательных веществ Ю. М. Возняковская, А. К. Труфанова, . При избытке последних, в среде, обильно заселенной бактериями, главным фактором подавления прорастания спор фитопатогенов становится конкуренция за питательные вещества. Отечественными учеными было установлено, что миколитическая активность бактерий в почвах зависит от различных условий, в том числе, от типа и влажности почвы, ее утомленности монокультурой, возраста гриба и его таксономической принадлежности, вида бактерий и т. Я.П. Худяков, . Это показывает, что миколитическая активность, являясь одним из важнейших типов антагонизма сапрофитных бактерий к почвенным микромицетам, в то же время представляет собой явление комплексного характера, которое нельзя объяснить действием какоголибо одного фактора. Однако первый процесс может протекать как следствие второго. Поэтому такое определение, скорее всего, подчеркивает, что бактериальный лизис грибов как совокупное явление может иметь различные механизмы. Наиболее распространенной является точка зрения о ферментативном характере миколитических процессов в почве, что подкрепляется достаточным количеством экспериментальных данных в этой области, начиная с работы по механизму лизиса i. Визуально процесс лизиса грибного мицелия бактериями подробно описан Я. П. Худяковым у грибов рода i. Позже К. Ii показали, что внеклеточные ферменты штамма i i лизирующего клетки i , также вызывают лизис живого мицелия этого и близких видов грибов. Литическое действие ферментов В.