Молекулярно-генетические особенности устойчивости к бета-лактамным антибиотикам грамотрицательных микроорганизмов - возбудителей нозокомиальных инфекций

• Автор: Мудрак, Дарья Евгеньевна
• Шифр специальности: 03.00.07, 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 140 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение

Цель и задачи исследования

Научная новизна

Практическая значимость

Основные положения, выносимые на защиту

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Механизм действия бетал актам ных антибиотиков. II

1.2. Механизмы антибактериальной устойчивости

1.3. Классификация и происхождение бетал актам аз

1.4. Характеристика сериновых беталактамаз

1.4.1. Беталактамазы класса А
1.4.2. Беталактамазы класса С
1.4.3. Беталактамазы класса Е.
1.5. Характеристика металлобеталактамаз МБЛ
1.6. Генетическая локализация беталактамаз
1.6.1. Генетическая локализация сериновых беталактамаз класса А.
1.6.2. Генетическая локализация МБЛ.
1.6.3. Генетическая локализация сериновых беталактамаз класса С.
1.7. Клиническое значение беталактамаз
1.7.1. Клиническое значение беталактамаз расширенного спектра БЛРС.
1.7.2. Клиническое значение беталактамаз АшрС
1.7.3. Клиническое значение МБЛ.
1.8. Детекция беталактамаз
1.8.1. Критерии чувствительности грамотрицательных микроорганизмов к беталактамным антибиотикам БЛА
1.8.2. Фенотипические методы детекции беталактамаз
1.8.3. Молекулярные методы в исследовании феномена устойчивости к БЛА.
1.9. Белковое моделирование
Глава 2. Материалы и методы исследования.
2.1. Бактериальные штаммы
2.2. Анализ фенотипов антибиотикорезистентности.
2.2.1. Определение чувствительности к антимикробным препаратам.
2.2.2. Фенотипические тесты на наличие беталактамаз
2.3. Идентификация штаммов методом прямого белкового профилирования.
2.4. Генетический анализ исследуемых штаммов.
2.4.1. Определение нуклеотидной последовательности гена
2.4.2. Выявление генетических маркеров устойчивости к
2.5. Моделирование пространственной структуры новой беталактамазы методом предсказания структуры по гомологии
Глава 3. Результаты
3.1 Использование метода прямого белкового профилирования для идентификации микроорганизмов, включенных в исследование.
3.2 Анализ чувствительности к антибиотикам грамотринательных микроорганизмов возбудителей нозокомиальных инфекций
3.2.1. Анализ профилей чувствительности клинических изолятов К. i
3.2.2. Анализ профилей чувствительности клинических изолятов представителей семейства i кроме К. i.
3.2.3. Анализ профилей чувствительности клинических изолятов . ii.
3.2.4. Анализ профилей чувствительности клинических изолятов . i.
3.3. Расшифровка механизмов устойчивости к БЛА у
грамотрицательных микроорганизмов возбудителей нозокомиальных инфекций
3.3.1. Расшифровка механизмов устойчивости К. i к БЛА.
3.3.2. Расшифровка механизмов устойчивости у представителей семейства i кроме
. i к БЛА
3.3.2.1. Случаи выявления у изолятов семейства i
3.3.2.2. Случай выявления МБЛ у штамма .i
3.3.3. Расшифровка механизмов устойчивости . ii
3.3.4. Расшифровка механизмов устойчивости Р.
i к БЛА.
3.4. Оценка чувствительности и специфичности фенотипических тестов для выявления беталактамаз различных классов.
3.4.1. Применение теста с клавулановой кислотой для выявления штаммов, продуцирующих БЛРС.
3.4.2. Применение трехмерного теста для выявления штаммов, продуцирующих беталактамазы класса С
3.4.3. Применение метода двойных дисков с этилендиаминтетрауксусной кислотой для выявления штаммов, продуцирующих МБЛ
Глава 4. Обсуждение
Заключение.
Выводы.
Список литературы


Беталакгамные антибиотики БЛЛ полярные гидрофильные соединения, проникающие в клетки бактерий через пориновые каналы внешней мембраны 6. Общим фрагментом в химической структуре БЛА является беталактамное кольцо, именно с его наличием связана микробиологическая активность этих препаратов. Мишенью действия БЛА в бактериальной клетке являются ферменты транс, эндо и карбоксипепгидазы. Они участвуют в синтезе основного компонента наружной мембраны микроорганизмов пептидогликаиа. Благодаря способности связываться с пенициллином и другими БЛА эти ферменты получили второе название пенициллинсвязывающие белки ПСБ. Молекулы ПСБ жестко связаны с цитоплазматической мембраной микробной клетки, они осуществляют образование поперечных сшивок. Связывание БЛА с ПСБ ведет к инактивации последних, БЛА препятствуют образованию пептидных мостиков и объединению пептидогликанов клеточной стенки бактерий в единую структуру блокируют эндо, транс и карбоксипептидазы, образуя с ними ковалентные связи. При этом происходит разрыв связи СИ в четырехчленпом цикле, входящим в структурное ядро всех беталактамов. Таким образом, уровень активности конкретных БЛА в отношении отдельных микроорганизмов в первую очередь определяется их аффинностью сродством к ПСБ. Чем ниже аффинность взаимодействующих молекул, тем более высокие концентрации антибиотика требуются для подавления функции фермента. Механизмы антибактериальной устойчивости. Снижение проницаемости внешней мембраны. Этот механизм в основном распространен среди грамотри нательных микроорганизмов, обладающих внешней мембраной. Он является наименее специфичным в отношении антибиотиков разных групп. Транспорт гидрофильных антибиотиков внутрь микробной клетки осуществляется через пориновые каналы. Нарушение проницаемости оболочки микробной клетки достигается путем угнетения экспрессии пормновых белков. Изначальная роль этих белков состоит в
пассивном транспорте аминокислот, но исследования показали, что они ответственны также за транспорт остальных БЛА , 4. При утрате этих белков эффективность транспорта антибиотика резко снижается, что проявляется в формировании устойчивости к нескольким классам препаратов. Изменение структуры ПСБ. Структура мишеней действия антибиотиков изменяется в результате спонтанных мутаций, делений, дупликаций в кодирующих их генах. Такие генетические переел ройки ведут к модификации мишени действия антибиотика н как следствие к снижению или утрате эффективности связывания мишени с антибиотиком. Активный транспорт антибиотика из клетки эффлюкс. Система эффлюкса это энергозависимый механизм, распознающий и выводящий из микробной клетки ряд химически и структурно экзогенных веществ без разрушения или изменения их структуры. Известно 5 больших семейств транспортных систем, обеспечивающих активное выведение экзогенных веществ из бактериальной клетки , , , и МАТЕ. Наиболее распространенные и многочисленные из них ii i т. АТФсвязывающих кассет. Гены систем эффлюкса обычно локализованы на хромосоме, однако есть данные о нахождении этих генов на мобильных генетических элементах 7. Базовая активность систем эффлюкса во многом определяет уровень природной чувствительности бактерий к антибиотикам. Инактивация антибиотика синтез беталактамаз ферментов, разрушающих антибиотики. Беталактамазный механизм резистентности микроорганизмов является, безусловно, наиболее действенным и распространенным. В результате реакции свободной гидроксильной группы аминокислоты ссрипа с бсталактамным кольцом антибиотиков образуется эфирный комплекс. При взаимодействии БЛА и ПСБ образующийся комплекс оказывается достаточно стабильным, благодаря чему и подавляется функциональная активность ПСБ. Комплекс, образующийся при взаимодействии антибиотиков и беталактамаз, оказывается крайне нестабильным. Вначале фермент нековалентно соединяется с антибиотиком, в результате образуется нековалентный комплекс Михаэлиса рис. Затем в результате реакции свободной гидроксильной группы аминокислоты серина, входящей в активный центр фермента, с беталактамным кольцом образуется нестабильный ацилэфирный комплекс, быстро подвергающийся гидролизу.