Молекулярные механизмы подавления антиинфекционных защитных систем клетки-хозяина на модели экспериментальной полиовирусной инфекции

• Автор: Кондратова, Анна Анатольевна
• Шифр специальности: 03.00.07, 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 106 с. : ил.

Введение

I. Обзор литературы.

1.1. Никорнавирусы.

1.2. По.тионирус.

1.2.2. Полиовирусная РНК

1.2.3. Белки полиовируса

1.2.4. Полиовирусный белок ЗА.

1.3. Апоптоз.

1.3.1. Общая характеристика.

1.3.2. Апоптоз, инду цируемый прямой стимуляцией рецепторов смерти и

1.4. Везикулярный белковый транспорт.

1.4.1. Общая схема
1.4.2.Цитоскслст и молекулярные моторы в мембранном транспорте белков
1.4.3. Динеин и аппарат Гольджи.
1.4.4. Разрушение аппарата Гольджи под воздействием дрожжевого метаболита брефельдина А
1.5. и его роль в регуляции функций динеина.
1.6. Клеточные функции пирина
1.7. Биоактивность квсрцстина
И. Материалы и методы
II. 1. Работа с культу рами эукариотических клеток.
И. 1.1. Клеточные линии, использованные в работе, и их культивирование
И. 1.2. Трансфекция
II. 1.3. Упаковка лснтивирусных частиц.
П. 1.4. Очистка вирионов и трансдукция.
II. 1.5. Определение эффективного титра вирусных частиц и множественности
заражения клеток.
.2. Работа с плазмидной ДНК и клонирование.
.2.1. Получение химически компетентных клеток .i.
.2.2. Трансформация химически компетентных клеток .i.
.2.3. Препаративное и аналитическое выделение плазмидной ДНК.
.2.4. Обработка ДНК эндонуклеазами рестрикции
.2.5. Фракционирование и извлечение ДНК из агарозных гелей.
.2.6. Лигирование ДНК
I.2.7. Векторы и плазм идные конструкции, использованные в работе.
.2.8. Получение конструкций, экспрессирующих полипептиды полиовируса
.2.9. Получение конструкций, экспрессирующих полноразмерные пирин и I1 и фрагменты
.2 Получение конструкций для экспрессии РНКшпилск для РНКинтерференции
II.4. Методы выделения и анализа белков
.4.1. Получение тотальных клеточных лизатов
.4.2. Приготовление ядерных экстрактов.
.4.3. Измерение концентрации белка по методу Бредфорда.
.4.4. Фракционирование белков, перенос на мембрану и иммунодетекция
.4.5. Им.мунопрсципитация
.4.6. Иммунофлуорссцснция
.4.7. Очистка белков метолом аффинной хроматографии с исолъзоваиисм пуллдау и.
.4.8. Измерение кверцетиназной активности пирина
.5. Экспрессия белков i vi
.6. Индукция апоптоза с использованием и антител к .
.7. Анализ ДНКбслковых взаимодействий методом сдвига элсктрофорсзной подвижности
.8. Метод цитофлуоресцен тного анализа
.9. Дрожжевая дву гибридная система.
III. Результаты и обсуждение
III. 1. Полиовирусныс белки 3 и ЗА блокируют апоптоз, индуцированный
фактором некроза опухоли. Ингибирование везикулярного транспорта белков между эндоилаз.чатичсским ретикулумом и аппаратом Гольджи как
потенциальный молекулярный механизм
III. 1.1. Получение минибиблиотеки плазмид, экспрессирующих неструктурные
белки полиовируса
П. 1.2. Полиовирусныс белки ЗА и 2В снижают чувствительность клеток и III к воздействию фактора некроза опухоли в присутствии
ингибитора белкового синтеза или полновирусной протеази 2А.
III. 1.3. ПВ белки 2В и ЗА подавляют везикулярный транспорт белков между эндоилазматичсским ретикулумом и аппаратом Гольджи.
III.2. Полиовирусный белок ЗА ингибирует зависимый апоптоз засчст
умсьшсния количества рецептора на клеточной поверности.
III.2.1. Белок ЗА и брефельдин А уменьшают количество 1 на клеточной поверхности
1.2.2. Полиовирусная инфекция подавляет деградацию 1кВа в ответ на обработку
1.2.3. 1 быстро исчезает с клеточной поверхности во время полиовирусной инфекции
II.2.4. Обработка не вызывает активацию в присутствии ЗА и брсфельдина А.
1.3. Поиск клеточных интсракторов полиовирусного белка ЗА методом скринирования библиотеки кДНК в дрожжевой двухгибридной системе
III.3.1. Изолирование клеточных белков, взаимодействующих с полиовирусным белком ЗА в дрожжевой двухгибридной системе.
ТП.3.2. Подтверждение взаимодействия ЗА с пирином и II i vi и i viv. .
1.4. II как клеточный интерактор ЗА
1.4.1. Колокализация II и ЗА в клетке.
1.3.2. Гиперэкспрсссия белка I1 снимает ингибирование белкового транспорта из ЭР в Гольджи полиовирусным белком ЗА
1.3.3. Гиперэкспрессия препятствует уменьшению количества 1 на клеточной поверхности, вызываемого ЗА.
1.3.4. Экспрессия и Сконцевых делеционных мутантов I1 уменьшает количество 1 на клеточной поверхности.
1.4. Пирин как клеточный интерактор ЗА.
Ш.4.1. Колокализация ЗА и гшрина в клетках , зараженных полиовирусом.
III.4.2. Чувствительность полиовирусной инфекции к квсрцстину коррелирует с
экспрессией пирина в различных клеточных линиях.
Ш.4.3. Квсрцстин в высокой концентрации ингибирует развитие полиовирусной инфекции в клетках .
II.4.4. Изменение количества пирина в клетках за счет гиперэкспрессии либо подавления методом РНКинтсрфсрскции модулирует устойчивость полиовирусной инфекции к воздействию кверцетина.
III.4.5. Белок ЗА не меняет квсрцстиназную активность пирина.
IV. Модель молекулярных механизмов подавления антиинфскционных защитных систем клеткихозяина в экспериментальной полиовирусной
инфекции
Выводы.
Благодарности
Список работ, опубликованных по теме диссертации
Список литературы


Список сокращений. I. Обзор литературы. Никорнавирусы. По. Полиовирусный белок ЗА. Апоптоз. Общая характеристика. Везикулярный белковый транспорт. Динеин и аппарат Гольджи. II. Работа с культу рами эукариотических клеток. И. 1. И. 1. II. Упаковка лснтивирусных частиц. П. 1. Очистка вирионов и трансдукция. II. Работа с плазмидной ДНК и клонирование. Получение химически компетентных клеток . Трансформация химически компетентных клеток . Препаративное и аналитическое выделение плазмидной ДНК. Фракционирование и извлечение ДНК из агарозных гелей. I.2. Векторы и плазм идные конструкции, использованные в работе. II. Приготовление ядерных экстрактов. Измерение концентрации белка по методу Бредфорда. Им. Очистка белков метолом аффинной хроматографии с исолъзоваиисм пуллдау и. Индукция апоптоза с использованием и антител к . Дрожжевая дву гибридная система. III. III. Ингибирование везикулярного транспорта белков между эндоилаз. III. П. 1. III. ПВ белки 2В и ЗА подавляют везикулярный транспорт белков между эндоилазматичсским ретикулумом и аппаратом Гольджи. III. III. II. Обработка не вызывает активацию в присутствии ЗА и брсфельдина А. III. Изолирование клеточных белков, взаимодействующих с полиовирусным белком ЗА в дрожжевой двухгибридной системе. ТП. Подтверждение взаимодействия ЗА с пирином и II i vi и i viv. Колокализация II и ЗА в клетке. Гиперэкспрессия препятствует уменьшению количества 1 на клеточной поверхности, вызываемого ЗА. Экспрессия и Сконцевых делеционных мутантов I1 уменьшает количество 1 на клеточной поверхности. Пирин как клеточный интерактор ЗА. Ш.4. Колокализация ЗА и гшрина в клетках , зараженных полиовирусом. III. Ш.4. Квсрцстин в высокой концентрации ингибирует развитие полиовирусной инфекции в клетках . II. Изменение количества пирина в клетках за счет гиперэкспрессии либо подавления методом РНКинтсрфсрскции модулирует устойчивость полиовирусной инфекции к воздействию кверцетина. III. Белок ЗА не меняет квсрцстиназную активность пирина. IV. Выводы. Список литературы. Список сокращений. АДФрибозилируюций факгор 1 от англ. I от англ. РНК, используемая для РНКинтерференции от англ. I короткая интерферирующая РНК от англ.