Получение и характеристика рекомбинантного белка TUL4, потенциального компонента генно-инженерной субъединичной противотуляремийной вакцины

• Автор: Лящук, Александр Михайлович
• Шифр специальности: 03.00.07, 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 105 с. : ил.

Введение.

Глава I. Обзор литературы

1. Краткая характеристика . i

1.1. Распространение и эпидемиология.

1.2. Биологические свойства

1.2.1. Классификация рода i

1.2.2. Морфология и культуральные свойства.

1.2.3. Биохимические свойства

1.2.4. Основные факторы патогенности.

1.2.5. Основные антигенные детерминанты . i

2. Профилактика туляремии 2

2.1. Живые вакцины.
2.2. Инактивированные вакцины
2.3. Рекомбинантные живые вакцины
2.4. ДНК вакцины. 2
2.5. Субъединичные генноинженерные вакцины
3. Использование технологии химерных белков для создания субъединичных генноинженерных вакцин
3.1. Целлюлозосвязывающий домен
3.2. Применение целлюлозы как иммуносорбента.
Глава II. Материалы и методы.
1. Материалы.
1.1. Бактериальные штаммы
1.2. Плазмидные векторы
1.3. Олигонуклеотиды.
1.4. Ферменты и другие реактивы
1.5. Лабораторные животные.
2. Методы
2.1. Выделение хромосомной ДНК.
2.2. Выделение и очистка аналитических количеств плазмидной
2.3. Выделение и очистка препаративных количеств плазмидной
2.4. Гидролиз ДНК специфическими эндонуклеазами
2.5. Фракционирование фрагментов ДНК методом электрофореза
в агарозном геле.
2.6. Препаративное разделение фрагментов ДНК и элюция
их из геля.
2.7. Лигирование фрагментов ДНК 4
2.8. Трансформация клеток Е, i
2.8.1. Подготовка компетентных клеток
2.8.2. Электропорация 4
2.9. Полимеразная цепная реакция.
2 Определение нуклеотидной последовательности ДНК
2 Электрофорез белков в ПААГДСН .
2 Выращивание штаммапродуцента и индукция синтеза
рекомбинантных белков.
2 Определение локализации белков в лизатах штаммапродуцента 4
2 Иммобилизация и выделение белков, содержащих целлюлозосвязывающий домен 4
2 Иммунизация лабороторных животных. 4
2 Иммуноблоттинг
Глава III. Результаты и обсуждение 4
1. Создание бактериальных штаммовпродуцентов белка
4 из . i.
1.1. Создание бактериального штаммапродуцента, обеспечивающего экспрессию и секрецию белка 4 в периплазму клеток . i.
1.1.1. Клонирование гена белка 4.
1.1.1.1. Получение ПЦР фрагментов гена белка 4
1.1.1.2. Клонирование гена белка 4 в векторе .
1.1.1.3. Секвенирование нуклеотидных последовательностей гена белка 4.
1.1.2. Создание экспрессионных векторов,
содержащих ген белка 4.
1.1.3. Создание бактериальных продуцентов белка 4
1.2. Создание бактериального штаммапродуцента, обеспечивающего экспрессию белка 4 в цитоплазме
клеток . i
1.2.1. Создание экспрессионного вектора, содержащего ген зрелого белка 4.
1.2.2. Создание бактериального продуцента гена зрелого
белка 4
1.3. Создание бактериального штаммапродуцента, обеспечивающего экспрессию химерного белка 4 в цитоплазме клеток . i.
1.3.1. Создание экспрессионных векторов, содержащих ген белка 4 в составе химерной конструкции с целлюлозосвязывающим доменом
1.3.2. Создание бактериальных продуцентов генов белков и 4
2. Оптимизация экспрессии химерных белков
и 4.
2.1. Оптимизация времени индукции.
2.2. Оптимизация индукции с помощью плазмиды I.
2.3. Индукция белков и 4 в
различных штаммах . i.
3. Изучение локализации химерных белков 4 и 4 в лизатах штамма . i 5.
4. Выделение и очистка белков 4 и
4.
4.1. Изучение связывания химерных белков
и 4 с различными видами целлюлозы.
4.2. Выделение и очистка химерных белков
и 4.
5. Определение антигенных свойств белка тиЬ4БрСВ0.
5.1. Получение кроличьих антисывороток к комплексу
тиЬ4 зрСВЭцеллюлоза
5.2. Исследование антигенных свойств.
Выводы
Список литературы


Список принятых сокращений. Введение. Глава I. Краткая характеристика . Распространение и эпидемиология. Морфология и культуральные свойства. Основные факторы патогенности. Основные антигенные детерминанты . Живые вакцины. ДНК вакцины. Применение целлюлозы как иммуносорбента. Глава II. Материалы и методы. Материалы. Олигонуклеотиды. Лабораторные животные. Выделение хромосомной ДНК. Выделение и очистка аналитических количеств плазмидной
2. Выделение и очистка препаративных количеств плазмидной
2. Полимеразная цепная реакция. Электрофорез белков в ПААГДСН . Иммунизация лабороторных животных. Глава III. Создание бактериального штаммапродуцента, обеспечивающего экспрессию и секрецию белка 4 в периплазму клеток . Клонирование гена белка 4. Клонирование гена белка 4 в векторе . Секвенирование нуклеотидных последовательностей гена белка 4. Создание экспрессионного вектора, содержащего ген зрелого белка 4. Создание бактериального штаммапродуцента, обеспечивающего экспрессию химерного белка 4 в цитоплазме клеток . Оптимизация времени индукции. Оптимизация индукции с помощью плазмиды I. Изучение локализации химерных белков 4 и 4 в лизатах штамма . Определение антигенных свойств белка тиЬ4БрСВ0. Исследование антигенных свойств. Список литературы. V американский живой вакцинный штамм . Введение. Актуальность проблемы. Туляремия язляется актуальной проблемой для здравоохранения в связи с широким распространением природных очагов в странах умеренного климатического пояса, а также возможной ролью возбудителя в качестве потенциального агента Оиотерроризма , , 0. Федерации применяется живая вакцина на основе РгапсБеНа Ьи1агспБ НИИЭГ, использование которой позволило снизить заболеваемость этой инфекцией до спорадических случаев или небольших вспышек , 5, . Р. цIлi . Р. Ьи1агепБз. Такими препаратами, например, могут быть субъединичные вакцины , , , 4. Г. Ьи1агепз1з и иммунных механизмах ответа макроорганизма. Тклеточному иммунитету. ОМС, представляющий собой комплекс наружных мембран, выделенный из вакцинного штамма . Г. i. Следует также отметить, что получение этих препаратов связано с необходимостью культивирования патогенных штаммов туляремии. Становится ясно, что для создания эффективных профилактических препаратов против туляремии необходим принципиально новый подход, направленный на получение стандартных рекомбинантных белков, обладающих высокой протектизностью, в том числе, за счет использования соответствующих адъювантов или иммуносорбентов. Цель работы. Исследование антигенных свойств препарата белка 4. Научная новизна. Впервые получен в препаративных количествах высокоочищенный рекомбинантный белок 4, потенциальный компонент генноинженерной субъединичной противотуляремийной вакцины. Впервые для обеспечения синтеза белка 4 в клетках ii i были сконструированы гибридные плазмиды, контролирующие синтез химерных белков 4 и 4. Данные химерные белки состоят из нуклеотидной последовательности зрелого белка 4, спейсера и целлюлозосвязывающего домена из i. Белки 4 и 4 отличаются и Сконцевым расположением последовательности белка 4. Впервые были получены эффективные бактериальные продуценты белка 4 в составе химерных белков 4 и 4 в клетках Е. М 4 и 5. Уровень экспрессии химерных белков составляет от тотального. На основе использования свойств целлюлозосвязывающего домена, входящего в состав химерных белков, была разработана эффективная схема очистки рекомбинантных белков 4 и 4 на целлюлозе. Степень чистоты препаратов составляла более .