Структурно-функциональный анализ мембранных белков вирусов в генетически трансформированных клетках

• Автор: Тугизов, Шароф Мавлонович
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 1996
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 244 с. : ил

1. Введение.

2. Получение и характеристика мутантных клонов человека и млекопитающих, пригодных для генетической трансформации клеток в культуре.

2.1. Литературная справка.

2.2 Селекция мутантных клеток, дефектных по генам ТК и ГФРТ.

2.3 Реверсионный анализ мутантных клонов. Стабильность мутантного фенотипа и факторы, влияющие на нее.
2.4. Оптимизация условии трансфекции. анализ эффективности и частоты трансформации мутантных клонов маркерными генами.

3. Анализ экспресии нваАд в генетически трансформированных клетках млекопитающих.

3.1. Литературная справка.

3.2. Временная экспрессия НВА.

3.3. Получение трансформированных клеток, стабильно экспрессирующих поверхностный антиген вируса гепатита В.
3.4. Сравнительный анализ экспрессии НВА в различных клетках. Влияние промоторов ЬТЯ ВСР и МТ1 мыши на экспрессию НВчА.
4. Роль клеточной дифференцировки в экспрессии генов вируса гепатита В.
4.1 Литературная справка.
4.2 Селекция клеточных клонов гепатокариипомы человека. проявляющих различную степень дифференцировки.
Особенности экспрессии и НВсА в высокодиффренннрованных и низкодифферен Кирова н пых клонах гепатокарциномы.
Цитогенетический анализ высокодифференцированных и ннзкодифферснцированных клонов гспагокаршшомы человека.
Структурнофункциональный анализ мембранных белков цитомегаловируса в генетически
трансформированных клетках глиобластомы человека.
Литературная справка.
Роль гликопротеина П ЦМВ в адсорбции и нроникиовеиим в клетки.
Получение генетически трансформированных клеток, экспрессирующих гликопротеин В цитомегаловируса человека.
Анализ функционально активных доменов
гликопротеина В ЦМВ. участвующих а елняниии
генетически трансформированных клеток.
Закономерности вирусной инфекции в полярных эпителиальных клетках.
Литсратурная си ра вка.
Особенности инфекции ЦМВ и ВПГ1 в полярных эпителиальных клетках сетчатки глаза человека.
Роль оболочечных белков ЦМВ и ВПГ1 в распространении инфекции через латеральные
мембраны полярных клеток.
Заключение.
Использование биохимически маркированных
клеточных линии для селекции генетически трансформированных клеток.
7.2. Анализ экспрессии в генетически трансформированных клетках. Временная и стабильная. конститутивная и индуцибельная экспрессия IIВ
7.3. Регуляция экспрессии НВн и НВс в клональных
сублиниях гспатокарциномы человека, проявляющих различную степень дифференинровки и
дедифференцнровкн.
7.4. Структурнофункциональный анализ оболочечных белков цнтомегаловируса и вируса простого герпеса в генетически трансформированных клетках.
7.5. Полярная инфекция цнтомегаловируса и вируса простого герпеса в эпителиальных клетках. Анализ экспрессии мембранных гликопротеинов вирусов в полярных эпителиальных клетках.
8. Выводы.
9. Литература.
Введение


В настоящее время клонированы маркерные гены ТК ВПГ типа 1 и 2. ГФРГ человека, китайского хомячка, мыши. АФРТ китайского хомячка, человека и созданы различные векторные конструкции. Ivi, v, i и др. Имеется также ряд мутантных клеточных линии, дефектных но ферментам ТК. ГфРТ и АФРТ. Однако, несмотря на бурное развитие клеточной биологии и биотехнологии наличие таких биохимически маркированных линий еш ограничено. Мутантные аналоги клеточных линий, наиболее часто используемых в вирусологических исследованиях, почти отсутствуют. Это затрудняет создание трансформированных клеток, экспрессирующих вирусные гены, на основе клеточных линий, интересующих исследователя. Поэтому получение новых мутантных клеточных линий, пригодных для генетической трансформации является актуальным. Генетически трансформированные клетки, экспрессирующие чужеродные гены. Селекция трансформантов из немаркированных клеток осуществляется с использованием гена аминоглнкозилфосфотрансферазы ЛГФТ. Тп5. В фосфотрансферази и гена дигидрофолатредуктазы ДГФР мыши i . ДГФР метотрексата П. Однако. ГК или ГФРТ для генетической трансформации имеет существенные преимущества перед немаркированными. Частота и эффективность трансформации маркированных клеточных линий во многих случаях в 0 раз выше, чем немаркированных клеток. Уровень и длительность экспрессии исследуемого гена в маркированных клетках также, как правило, относительно высоки и стабильны. Поэтому, олной из наших задач являлось получение мутантных клеток, имеющих маркерные свойстпа. Основным критерием для выбора клеточных линий для исследований была широкая распространенность этих клеток в вирусологических работах в нашей стране. Первые шаги для реализации этою подхода были начаты нами в начале х годов. Ьыли получены ТКклетки почки эмбриона свиньи СЭВ1 и ГФРГк летки трахеи эмбриона коровы ТР. Тугизов Дьяконов, Кущ. Тугнзов. Гугизов и др 1. Развивая этот подход, мы получили серии мутантных клеток гспатокарииномы человека 5, почки зеленой мартышки СVI, лимфобластомы СЕМ и глиобластомы 3 человека, имеющих дефект по генам ТК и ГФРТ Тугизов и др а Тугизов и др 6 Тугизов и др. Селекция мутантных клеток, дефектных по генам ТК и ГФРТ. СЕМ. СЭВ. V1. ТР. Клетки 5, V1 и СЕМ были получены из лаборатории культур тканей института Вирусологии ЛИ. Ивановского РАМН. СПЭВ и ТР из лаборатории культур тканей и питательных сред Института Экспериментальной Ветеринарии РАСХНИЛ. Амерканской коллекции клеточных культур АТТС. ТК и ГФРТдефекта их клеток. Поэтому все эксперименты по селекции мутантов били проведены многошаговым методом. ТК и ГФРТ были использованы следующие мутагены этилметансульфоват ОМС. В. метилнитронитрозогуанилин i. ГФРТ. А Г. ТГ. ММ для отбора клеток, дефектных но гену ТК, 5броы2дсзоксиурнлин БДУ i. Также была определена эффективность клонирования культур, поскольку изолирование единичных мутантных клеток в селективных условиях зависит от клонообразуюшен способности клеток Табл. Установлено, что метаболическая кооперация п клетках Р1. С7РКР и ТР проявляется при посеве выше, чем И2клсм2Частота возникновения мутантных клонов по гену ГФРТ при такой плотности была . Интересно отметить, что частота возникновения мутантных клонов клеток РЬСРЯР5 но гену ТК была на порядок выше, чем по ГФРТ. Клонообразуюшая способность этих культур была очень низкой 0 В клетках СПЭВ и СЧМ метаболическая кооперация проявлялась при посеве выше, чем клсм2 Частота возникновения мутантов по гену ТК была очень высокой 4 для клеток СПЭВ и 5 для клеток БУ. Клонобразуюшая способность этих клеток достигала . Клетки глиобласгомы Ъ3МО проявляли метаболическую кооперацию при посевной концентрации выше, чем 2клсм2. Эффективность клонирования клеток глиобласгомы составляла . Концентрационный эффект клеток СЕМ, обеспечивающий метаболическую кооперацию в селективных условиях, определить не удалось, т. ООклмл не были обнаружены псевдомутанты, что. Частота возникновения мутантов клеток СЕМ. ТК. Таблица I. Оптимальные параметры селекции мутантных к. ТК. Клетки Концентра иия БДУ. Таблица 2. ТР ТГ 0.