Выявление индивидуальных белков вируса гепатита С и определение частоты их встречаемости в клетках печени больных хроническим гепатитом С с помощью моноклональных антител

• Автор: Адбулмеджидова, Анисат Газиевна
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 137 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Молекулярнобиологическая организация вируса гепатита С

1.1. Организация вирусного генома

1.2. Структура и функции белков

Глава 2. Инфекция, вызываемая ВГС

2.1. Эпидемиология вирусного гепатита С

2.2. Клиническое течение гепатита С

2.3. Гуморальный и клеточный ответы при ВГСинфекции Глава 3. Методы лабораторной диагностики
вирусного гепатита С
3.1. Выявление антител к белкам ВГС
3.2. Выявление РНК ВГС Глава 4. Применение моноклональных антител для детекции
вирусных белков ВГС
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Глава 5. Получение МКА к рекомбинантным
белкам , 3, 5
5.1. Рекомбинантные белки , 3, 5 вируса гепатита С
5.2. Синтетические пептиды
5.3. Иммунизация
5.4. Слияние клеток и скрининг гибридом
5.5. Выделение МКА из асцитных жидкостей и определение концентрации белка
5.6. Субтипирование МКА и определение типов легких цепей
в составе иммуноглобулинов
5.7. Твердофазный иммуноферментный анализ тИФА
5.8.Твердофазный ИФА с денатурированным антигеном
5.9.Конкурентный вариант тИФА
5.Ю.Эпитопное картирование
5. .Иммуноблот
5Истощение МКА
Глава 6. Характеристика пациентов
Глава 7. Выявление белков ВГС i i
7.1. Выявление белков ВГС в трансфицированных
клетках методом иммуногистохимии ИГХ
7.2. Получение криостатных срезов печени
7.3. Окрашивание клеток авидинбиотиновым комплексом
7.4. Непрямой иммунопероксидазный метод
иммуногистохимии
7.5. Определение маркеров лимфоцитов периферической крови
Глава 8. Детекция вирусной РНК
Глава 9. Статистическая обработка результатов
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Глава . Получение и характеристика МКА
.1. Получение МКА к рекомбинанатным белкам
, 3, 5
.2. Иммунохимические свойства МКА
.3. Эпитопная специфичность МКА
.4. Взаимодействие МКА с денатурированным антигеном
.5. Реципрокный конкурентный анализ МКА
.6. Способность МКА конкурировать с антителами в
сыворотках от больных с хроническим генатитом С .
Глава . Выявление белков ВГС
.1. Использование МКА для изучения распределения
белков ВГС в трансфицированных клетках
.2. Оптимизация метода выявления белков ВГС на
криостатных срезах печени
.3. Изучение способности МКА к белкам ВГС выявлять натуральные антигены в клетках печени больных ВГС
.4. Изучение экспрессии вирусных белков в клетках печени
у пациентов с хроническим генатитом С
.5. Детекция белков ВГС в лимфоцитах периферической крови Глава . Выявление РНК ВГС Глава . Исследование иммунологического статуса
у больных ХГС
Глава . Изучение взаимосвязи между обнаружением белков ВГС и вирусологическими, клиническими, биохимическими и гистологическими характеристиками печени больных с хроническим генатитом С
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


На основе полученных МКА разработан метод выявления белков ВГС на криостатных срезах печени и в препаратах ЛПК больных ХГС. Основные положения, выносимые на защиту. МКА, полученные в ходе выполнения работы, направлены к различным антигенным детерминантам белков , 3 и 5 ВГС. Разработан иммуногистохимический метод выявления вирусных белков на криостатных срезах печени и в ЛПК больных ХГС с использованием полученных МКА. Индивидуальные белки ВГС выявляются в клетках печени пациентов с ХГС с различной частотой. Не обнаружено корреляции между накоплением вирусных белков в печени и активностью хронического гепатита С. Установлено, что частота выявления вирусных белков в ЛПК значительно ниже, чем в клетках печени больных ХГС. При этом в ЛПК частота обнаружения белка нуклеокапсида выше, чем неструктурных белков ВГС, тогда как в клетках печени чаще других белков выявляется неструктурный белок 4. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Глава 1. Молекулярнобиологическая организация вируса гепатита С. Организация вирусного генома. Вирус гепатита С ВГС был открыт в году японскими учеными . Данные нуклеотидной последовательности генома позволили отнести ВГС в отдельный род ivi в семействе vivii. Это семейство включает в себя флазивирусы, пестивирусы 8. ВГС занимает промежуточное положение между флави и пестивирусами. В настоящее время определена полная первичная структура генома вируса гепатита С. На основе расхождения последовательностей нуклеотидов различных изолятов выделяют 6 генотипов, которые состоят из ряда субтипов. Возможности полного изучения структуры ВГС ограничены сложностями культивирования вируса и получения его в препаративных количествах. С помощью электронномикроскопических и седиментационных методов показано, что вирион представляет собой частицу диаметром 3 нм, коэффициент седиментации около 0 . Исследование плавучей плотности вирионов ВГС показало, что вирус, выделенный из плазмы больного острым гепатитом С и экспериментально зараженной шимпанзе, имел плавучую плотность в градиенте сахарозы 1. Обнаружение в сыворотке крови больных хроническим гепатитом С частиц с более высокой плавучей плотностью 1. ВГС с антителами в составе иммунных комплексов 1, 7. Нуклеокапсид вириона сформирован вирусспецифическим белком , связанным с геномной позитивной молекулой РНК 3. 2, нековалентно связанных между собой . Е2белок также связан с субгеномной негативной цепью РНК ВГС 2. Геном ВГС состоит из одноцепочечной линейной позитивной молекулы РЖ размером нуклеотидных остатков и. Обнаружена одна отхрытая рамка считывания , фланкированная с двух сторон нетранслируемыми областями 5 и 3 . Последовательность кодирует полипротеинпредшественник, в результате процессинга которого образуются структурные и неструктурные вирусные белки. Рис. является высоко консервативной областью генома. Этот регион образует сложную вторичную структуру, которая формирует сайт связывания рибосомы 1, расположенный между и 5 н. ВГС. Этот участок необходим для инициирования сарнезависимой трансляции 8, 0. Было показано, что первые н. Предполагают, что этот участок вовлечн в репликацию ВГС . К настоящему времени установлено, что трансляцию вирусной РЖ активирует последовательность, входящая в состав 3 Xi 5. Кроме того, обнаружены белки клеткихозяина, которые связываются с 1 и могут стимулировать процесс трансляции полипиримидин связывающий протеин РТВ, гетерогенный ядерный нуклеопротеин , антиген и неидентифицированные белки р, р и р0 , . Длина области, кодирующей полипротеин вируса гепатита С, варьирует от до н. Наиболее консервативные участки генома кодируют и ЫБ5протеины, наиболее вариабельные кодируют поверхностные белки и Е2 . Вариабельность связана с высокой степенью мутаций. В результате образуется большое число разных генотипов, субтипов, квазивидов ВГС 2. Различия в нуклеотидной последовательности между генотипами достигает 7.