Иммунохимическая и молекулярная диагностика вирусных инфекций растений

• Автор: Чирков, Сергей Николаевич
• Шифр специальности: 03.00.06, 03.00.23
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 239 с. : ил.

Введение

Обзор литературы

Глава 1. Им.чуиохнмические методы определенна вирусов растений

Метод иммуноферментного анализа ИФЛ

Метод иммунохромато1рафии ИХА

Глава 2. Молекулярные методы определения вирусов растений

Молекулярногибридшациониый анализ МГА

Полимеразная цепная реакция П1 Р

ПЦР в реальном времени .

ДНКчипы

Экспериментальная часть

Глава 3. Разработка и усовершенствование методов препаративного
выделения вирусов растений и получение моноспецифических антмсынороток
Препаративное выделение вируса кольцевой пятнистости малины
Препаративное выделение неиовирусов черной кольцевой пятнистости томатов и вируса мозаики арабнеа Препаративное выделение латентного вируса кольцевой пятнистости земляники
репаративное выделение вируса некроза табака
Препаративное выделение вируса А картофеля
Препаративное выделение вируса шарки оспы сливы
Препаративное выделение вирусов X картофеля, табачной мозаики, У картофеля и крапчатости гвоздики Препаративное выделение вируса мягкой мозаики фасоли
Определение таксономического положения ВММФ
Глава 4. Разработка тестснсгем для иммуноферментною определении
вирусов растений
Аналитические характеристики тестсистемы для диагностики
вируса шарки сливы Аналитические характеристики тестсистем для диагностики
вирусов картофеля
Аналитические характеристики тестсистем для диагностики
нсповирусов
Аналитические характеристики тестсистем для диагностики
вирусов некроза табака, мягкой мозаики фасоли, табачной мозаики и крапчатости гвоздики Разработка и характеристика наборов для диагностики вирусов
картофеля и вируса шарки сливы Глава 5. Определение вирусов растений методом виробактериальной
агглютинации АБВтест
Глава 6. Разработка и му нохроматографическнх тестсистем
дли диагностики вирусов растений
Конструирование и оптимизация тестполосок
Определение аналитических характеристик тестполосок
Апробация тсстполосок для анализа зараженности растений картофеля 6 Разработка набора для внелабораторного применения тестполосок
Глава 7. Определение вирусов растений с помощью МГАИФАтсхнологин
Разработка нового метода экстракции нуклеиновых кислот из
вирусных частиц и растений с помощью грихлорацетата аммония Аналитические характеристики МГАИФАтехиологии и се применение 3 для определения вирусов растений Разработка ОТПЦРМГАИФАтехнологии для диагностики вирусов
Глава 8. Диагностика вируса шарки сливы с помощью полимеразной
цепной реакции
Глава 9. Диагностика вирусов и вкроила картофеля с помощью ДНК
микроплаты
Глава . Применение разработанных методов диагностики для решения
практических задач бсзвирусного растениеводства
Диагностика вирусных инфекций в элитном семеноводстве картофеля
Диагностика вирусных инфекций плодовых и ягодных культур для
получения бсзвирусного посадочного материала Применение тестсистемы для диагностики вируса шарки сливы в
карантинных исследованиях Диагностика вирусных инфекций цветочнодекорагивных культур для
получения бсзвирусного посадочного материала
Глава . Индукция у растений устойчивости к заражению вирусами
Характеристика противовирусной устойчивости, индуцированной
хитозаном
Роль структуры в противовирусной активности хитозана
Изучение механизма противовирусной активности хитозана
Заключение
Выводы
Список литературы


Такая высокая чувствительность была достигнута во многом благодаря пренебрежимо низкому уровню фонового окрашивания в отрицательных контролях. Важнейшей особенностью ИФА с использованием НПФ оказалась та, что различия между положительными и отрицательными образцами ввиду контрастного перехода цветов были хорошо видны невооруженным глазом, и поэтому результаты фотометрической и визуальной детекции практически совпадали даже при низкой концентрации вируса в образце. Таким образом, использование в качестве ферментной метки НПФ позволяло выполнять ИФА в отсутствие спектрофотометра без ущерба для чувствительности анализа. Это обстоятельство могло иметь большое практическое значение, поскольку давало возможность применять этот вариант анализа в большинстве региональных лабораторий, порой недостаточно оснащенных. Еще одной особенностью этого варианта ИФА. Определение вирусов растений в непрямом варианте ИФА. В настоящее время планшетный сэндвичвариант ИФА выглядит практически идеальным решением задачи массовой экспрессдиагностики вирусных инфекций, поэтому не вызывает сомнений, что в таком формате метод будет широко применяться для этой цели и в обозримом будущем. В то же время, непрямой дотвариант ИФА, хотя и применяется в диагностических целях реже, обладает рядом собственных достоинств. Поскольку при использовании метода тканевых отпечатков процедура анализа не требует приготовления экстракта, она является мснсс трудоемкой, чем планшетный вариант ИФА, и позволяет с той же, в целом, чувствительностью анализировать 1 2 тыс. Важным преимуществом этого варианта является возможность нанесения образцов на мембрану непосредственно в полевых условиях с последующим их анализом в лаборатории. Мембраны с нанесенными образцами могут храниться при
комнатной температуре до 4 недель в условиях, исключающих попадание ныли, что лает возможность пересылать их по почте для лабораторного анализа. Емкость нитроцеллюлозной мсбраны обеспечивает связывание до мкг белка на 1 кв. Важнейшим достоинством непрямого ИФА в различных его варинтах является возможность применения только одного аитивидового конъюгата, что способствует повышению воспроизводимости результатов анализа. Следует также отметить, что в дотварианте непрямого ИФА предпочтительно использование хемилюминесцентного субстрата, который, вопервых, обеспечивает значительно большую чувствительность выявления вируса по сравнению с хромогенным субстратом и, вовторых, исключает влияние пигментации нанесенного образца на оценку результатов реакции V е а1. Ши, . Одновременное определение нескольких вирусов а одном образце. До последнего времени метод ИФА давал возможность выявлять одновременно в данном образце только один вирус. Разработка варианта ИФА на основе технологии Гитшех хМАР . В этой технологии в качестве твердой фазы для сорбции антител применяют полистироловыс гранулы диаметром 5,6 мкм. Гранулы окрашены двумя флуорофорами, различное сочетание которых придает каждому набору микросфер уникальные спектральные характристики. Анализ выполняют обычно в формате ТАБЕПБА с использованием моноклональных антител к вирусу и антител к мыши, меченных, например, фикоэритином. Важно отметить, что анализ происходит в суспензии, т. ИФА, а в качестве емкости для его проведения используется обычный луночный планшет. Спектральные свойства микросфер сопоставляются с наличием связанной с ними фикоэритриновой метки посредством лазерной цитомстрии в потоке, причем внутренний диаметр канала таков, что позволяет оценивать каждую гранулу в отдельности. Поскольку к настоящему времени корпорацией Ьшшпех создано 0 наборов гранул с уникальной для каждого набора спектральной характеристикой, теоретически применение этой технологии дает возможность в одной лунке луночного планшета определять до 0 вирусов одновременно. Первые опыты по применению этой технологии для определения вирусов растений продемонстрировали высокую, характерную для ИФА чувствительность и специфичность диагностики некоторых вирусов картофеля и вируса шарки сливы Веепюе е а1. СгоЙ е1 а.