Определение антигенных детерминант белков вируса гепатита С методом фагового дисплея

• Автор: Перебоева, Лариса Александровна
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Кольцово
• Количество страниц: 162 с.

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Вирусный гепатит С. Характеристика возбудителя и вызываемой им инфекции

1.1.1.Строение вириона и организация генома ВГС

1.1.2. Вариабельность генома ВГС.

1.1.3. Эпидемиология ВГС инфекции.

1.1.4. Иммунитет при ВГС инфекции

1.1.4.1. Гуморальный иммунный отвег при ВГС инфекции.

1.1.4.2. Клеточный иммунный ответ при ВГС инфекции.

1.1.5. Диагностика ВГС инфекции.

1.1.6. Картирование и поиск антигенных детерминант ВГС.

Заключение
1.2. Использование метода фагового дисплея для определения антигенных регионов.
1.2.1. Общие принципы метода.
1.2.2. Биология нитчатых бактериофагов.
1.2.3. Общие принципы, с помощью которых пептиды, экспонированные на поверхности бактериофага, могут быть аффинно селектированы на молекуле лигата
1.2.4. Параметры дисплея пептидов в составе фага.
1.2.5.рнмеры использования метода фагового дисплея.
Заключение
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Материалы
2.2. Молекулярнобиологические методы.
2.2.1. Работа с бактериальными культурами
2.2.2. Выделение и очистка плазмидных ДИК
2.2.3. Трансформация Е.соН плазмидной ДНК
2.2.4. Расщепление ДНК рестрикционными ферментами
2.2.5. Дсфосфорнлированис плазмидной ДНК.
2.2.6. Реакция лигирования ДНК.
2.2.7. Выделение суммарной РНК из ВГСпозитивных сывороток. Получение кДНК ВГС.
2.2.8. Полимеразная цепная реакция.
2.2.9. Клонирование амплифицированных кДНК.
2.2 Определение нуклеотидных последовательностей секвеннрованием ДНК по Сэнгеру.
2.2 Очистка белков мсталохслатной хроматографией.
2.2 Иммунофсрментный анализ
2.2 Электрофорез белков в полиакриламидном геле.
Иммуноблотгинг.
2.3. Методы используемые в технике фагового дисплея.
2.3.1. Титрование фагев
2.3.2. Выделение репликативной формы ДНК фага
2.3.3. Получение препаратов фаговых частиц прецшигтацией ПЭГ и выделение одноцепочечной ДНК из фашвых частиц
2.3.4. Получение препаратов поликлональных антител, направленных против индивидуальных белков ВГС нз сыворотки крови.
2.3.5. Аффинная селекция эпитопов из фаговых библиотек пептидов
2.3.5.1. Биоианнинг
2.3.5.2. Амплификация
2.3.5.3. Выявление позитивных клонов.
2.3.6. Создапне библиотек генных фрагментов
2.3.6.1. Фрагментация нуклеотидной вставки.
2.3.6.2. Подготовка ДНКазпых фрагментов для лигирования с фаговым вектором ЮЬЕ2
2.3.6.3. Конструкция и скрининг библиотеки генных фрашентов
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.
3.1. Получение и проверка рекомбинантных белков вируса гепатита С
3.2. Отбор антиВГС сывороток для биопаннинга.
3.3. Аффинная селекция пептидных последовательностей с
использованием поликлональных антиВГС положительных сывороток система Б
3САТ
3.4. Аффинная селекция пептидных последовательностей с использованием фракций очищенных антиВГС антител система Б8ААТ
3.5. Создание библиотек генных фрагментов и применение их для картирования антигенных детерминант ВГС
3.6. Создание комбинированного рекомбинантного антигена
ПРИЛОЖЕНИЕ К ГЛАВЕ 3.1. РЕЗУЛЬТАТЫ.
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВА 1НОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ААТ аффннноочищснные антитела
а.о. аминокислотный остаток
АЛТ аланннаминотрансфераза
АТ антитела
АТФ аденозин5трифосфат
Б3САТ система селекции с использованием библиотеки мсрных случайных пептидов, представленных на белке i, и
Н8А АТ система селекции с использованием библиотеки мерных случайных пептидов, представленных на белке VII, и ААТ БСА бычий сывороточный альбумин
БСП библиотека случайных пептидов
ВГС вирус гепатита С
ВИЧ вирус иммунодефицита человека
ГЦК гепатоцеллюлярная карцинома
ДАБ диамииобензидин
ДНК дезоксирибопуклеиновая кислота
дНГФ деадксинуклеозид5трнфосфаг
ДСП додецилсульфат натрия
ИПТГ изопропиягиогалактознд
ИФЛ имхоноферменптый анализ
кДа килодальтон
кДНК кодирующая ДНК
КОЕ колониеобразующая единица
п.о. нуклеотидный остаток
НТР нстранслируемый регион
обмин обороты в минуту
ОП оптическая плотность
ОРТ открытая рамка трансляции
ОТПЦР полимеразная ценная реакция с обратной транскрингазой ОФД ортофенилендиамин
ПЛАТ полиакриламидный гель
ПААГЭ электрофорез в полиакриламидном геле
п.н. пара нуклеотидов
пцр полимеразная цепная реакция
ПЭГ пояиэтиленглнколь
РНК рибонуклеиновая кислота
РФ репликативная форма фаговой ДНК
САТ сывороточные антитела
сод суиероксиддисмутаза
ТБЕ трисбо ратный буфер с ЭДТА
ТБС солевой раствор, забуференный трисом
ТБСТ ТБС с добавленным твин
ТЭ триобуфер с ЭДТА
ТЕМЭД тетрамсти лэтилендиами н
ЦСЖ цереброспинальная жидкость
ЦГЛ циготоксические лимфоциты
ЭДТА этилендиаминтетраацетат
эио эритропоэтин
ЭПР эндоилачмагичсский регикулум
i
V ivi i гипервариабельный регион
I иммуноглобулин
1 i i ii i внутренний сайт связывания
рибосом
пестртауркый белок
III продукт гена III нитчатого бактериофаг а
VIII продукт гена VIII нитчатого бактериофага
I i i
ВВЕДЕНИЕ


Анализ выявленных послсдовагельносгей для установления их сходства с первичной аминокислотной последовательностью белков ВГС. Создание химерного антигена с повышенной специфичностью комбинированием двух антигенных районов белка . Научная новизна и практическая ценность. В результате проделанной работы клонированы 5 фрагментов кодирующих регионов генома ВГС, соответствующие кор, , 2 фрагмента и . Источником ВГС РНК служили образцы сывороток пациентов с гепатитом С. Определены полные нуклеотидные последовательности всех клонированных фрагментов. Проведено сравнение с имеющимися в базе данных последовательностями кДНК штаммов ВГС. Установлено, что все последовательности имеют наибольшее сходство с штаммом ВГС . Клонированные фрагменты генома ВГС в дальнейшем служили основой для создания фаговых библиотек генных фрагментов. Получены штаммыпродуценты рекомбинантных белков кор. ЕТ н белка 4 с использованием вектора рЕТ. Подтверждена специфичность всех рекомбинантных белков в Вестерн блотс с ВГСположнтельными и отрицательными сыворотками. Полученные и очищенные препараты рекомбинантных белков ВГС использовали для определения антиВГС антител в сыворотке крови и для аффинного фракционирования антител, специфичных к отдельным белкам ВГС. При использовании метода фагового дисплея случайных пептидов получено 7 пептидных последовательностей, соответствующих антигенным детерминантам структурных кор и неструктурных , белков ВГС. Антигенные детерминанты соответствовали а. В системе биопашшнга на анти антителах, получены последовательности пяти пептидов, специфически взаимодействующих с антиВГС положительными сыворотками, но не имеющих гомологии с последовательностью белка . Высказано предположение, что данные последовательности имитируют коиформацнонкую детерминанту, представленную на белке . Впервые в контексте поиска антигенных детерминант ВГС созданы и примснснены фаговые библиотеки генных фрагментов. Антигенные детерминанты, обнаруженные на белке . При помощи комбинирования двух ан тигенных районов белка одного, полученного прямым клонированием , и другого, выявленного методом фагового дисплея ЫР, создан химерный антиген НРЫН. ВГС антител в сыворотках. Клонирование пяти фрагментов кДНК генома ВГС, соответствующих кор, 3. Сравнение полной нуклеотидной последовательности всех фрагментов с нуклеотидными последовательностями штаммов ВГС 1а и , хранящимися в базе данных. Получение в препаративных количествах очищенных рекомбинантных белков кор, 3, 4, 5 с использованием прокариотических экспрессионных систем. Подтверждение специфичности реакции полученных рекомбинантных белков в иммуноблотгинге с ВГСположитсльными сыворотками. Выявление псптидовмимстиков 7ми антигенных детерминант ВГС, соответствующих а. ВГС положительных сывороток и аффинкоочищенных антиВГС антител. Выявление пяти пептидных последовательностей в системе биопаннинга на анти 5 антителах, специфически взаимодействующих с антиВГС положительными сыворотками, но не имеющих сходства с первичной последовательностью 5. Высказано предположение, что данные последовательности имитируют копформационную детерминанту, представленную на белке 5. Картирование антигенных детерминант на неструктурных белках ВГС 3. Создание комбинированного антигена с повышенной специфичностью в реакции с ВГСположитсльными сыворотками. Апробация и публикации. Результаты работы были представлены на Международном семинаре i ii Vi , на Международном симпозиуме i i ivi , на юбилейной конференции посвященной тридцатилетию журнала Молекулярная биология Москва . Результаты обсуждались на семинарах в I, x, и , , ii, . По материалам работы опубликованы 2 статьи и тезисы 4 докладов. Vv . V., iv , v , v , v , v v i i i. Iiii V i i i i i ii i ii. Кардиф. Псребосва Л. А., Перебоев Г. Е., Моррис Г. Е. Изучение антигенных районов вируса гепатита С методом фагового дисплея. Мол. Т С. V, i Iiii ii i ii С vi i i i i ii. Vi. V . С Vi. Ii i i. V. i . С i i i iv ii i ii i. Vi в печати. Автор приносит благодарность Перебоеву Л. В. за практическую помощь и критические замечания в процессе диссертационной работы Красных В. Н. за обсуждение работы.