Механизмы взаимодействия вирусов с митохондриями

• Автор: Зорова, Любава Дмитриевна
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 159 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Взаимодействие частиц вирусов растений с клеточными мембранными структурами

1.1. Взаимодействие с хлоропластами

1.2. Взаимодействие с митохондриями.

2. Две стратегии, реализуемые при вирусном вторжении в клетку.

3. Апоптоз. Исторический аспект вопроса.

4. Апоптоз. Современные представления

4.1. Общие представления

4.2. Каспазы

4.3. Участие митохондрий в регуляции активности каспаз.

История вопроса и основные данные и постулаты.
4.4. Участие активных форм кислорода АФК в апоптозе.
4.5. Роль трансмембранного потенциала ионов водорода в
активации апоптоза
5. Неспецифическая проницаемость митохондрий
5.1. Общие представления
5.2. Индукция неспецифической проницаемости внутренней
мембраны митохондрий
5.3. Ингибирование неспецифической проницаемости митохондрии
5.4.Трансмембранный потенциал как регулятор
неспецифической проницаемости.
5.5. Окислительно восстановительное состояние пиридиновых нуклеотидов и БН групп белков.
5.6. Роль в регуляции неспецифической проницаемости
5.7. Вляние конформационного состояния транслокатора адениновых нуклеотидов на индукцию митохондриальной поры.
5.8. Свободные радикалы и другие активные формы кислорода в регуляции
неспецифической проницаемости митохондриальной мембраны
5.9. Вероятные механизмы индукции неспецифической проницаемости
5 Каким образом неспецифическая проницаемость митохондрий участвует в апоптотическом каскаде
. Апоптозиндуцирующий фактор А1Б
. Цитохром С.
. Другие проаполтотические белки.
6. Апоптоз, как результат борьбы двух стратегий при вирусном вторжении
6.1. Апоптоз животной клетки.
6.2. Апоптоз растительной клетки.
7. Участие митохондрий в вирусиндуцированном апопотозе
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1 .Выделение ВТМ .
2.Выделение РНК ВТМ фенольным методом
3. Выделение белка оболочки ВТМ
4. Получение препаратов белка оболочки ВТМ в различных
агрегационных состояниях
4.1.Получение препаратов Б агрегатов белка оболочки ВТМ,.
4.2.Получение препаратов реполимеризованного белка ВТМ.
5. Измерение спектров поглощения цельного вируса, РНК и белка
6. Обработка ЭГТА
6.1. Препараты цельного вируса табачной мозаики
6.2. Препараты изолированной РНК ВТМ.
7. Термическое разрушение ВТМ.
8. Выделение митохондрий печени крысы
9. Измерение митохондриальных параметров.
. Спектрофотометрические измерения содержания цитохрома С
X
. Синтез и свойства сополимера стирола, малеинового ангидрида и метакриловой кислоты
.1. Синтез полианиона.
.2.Получение флюоресцеинмеченного сополимера.
.3. Определение молекулярной массы полианиона и
молекулярно массового распределения.
. Электронная микроскопия.
. Определение содержания Са2 в препаратах вируса.
. Используемые реактивы.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
1.Регистрация параметров функционирования изолированных митохондрий печени крысы
2. Действие интактных вирионов ВТМ и его белка оболочки на функционирование митохондрии печени крысы.
3. Электронномикроскопические исследования взаимодействия интактных вирионов ВТМ с митохондриями
4. Влияние РНК ВТМ на функциональные параметры митохондрии
5. Электронномикроскопические исследования влияния РНК ВТМ
на морфологию митохондрий печени крысы
6. Моделирование структуры РНК ВТМ синтетическим полианионом
7. Электронномикроскопические исследования влияния
полианиона на морфологию митохондрии печени крысы
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Интерес к этой проблеме объясняется тем, что основными симптомами при системной инфекции ВТМ являются мозаика, т. Вполне естественным представляется предположение, что оба вида симптомов должны быть связаны с нарушением структуры иили функционирования хлоропластов. В старых работах основным методом обнаружения частиц ВТМ в хлоропластах был метод электронной микроскопии. С помощью этого метода Эссау и Кроншоу обнаружили вирусоподобные частицы в хлоропластах зараженных ВТМ растений и предположили, что в хлоропластах происходит и синтез этих частиц. Позже было показано, что разные штаммы ВТМ отличаются в способности индуцировать появление вирусоподобных частиц 1, . В этих работах было обнаружено, что частицы ВТМ штамма в 1 хлоропластов непосредственно инфицированных листьев табака и в хлоропластов системно инфицированных листьев. В случае же штамма 5, частицы вируса обнаруживались более чем в хлоропластов непосредственно инокулированных листьев табака. ВТМ. Однако Бэтто с сотрудниками в году сообщили, что они не обнаружили повышения уровня синтеза РНК в хлоропластах листьев, зараженных штаммом 5 ВТМ . Полученные данные вызвали интерес к дальнейшему изучению вопроса локализации сайтов синтеза ВТМ штамма 5 и в году Шалла с сотрудниками сообщили, что большинство ВТМподобных частиц, обнаруживаемых в хлоропластах, имеют длину всего около 5 нм в среднем 0 нм, что составляет примерно длины вириона ВТМ, и таким образом, не могут содержать полномерную вирусную РНК 2. Позднее было высказано предположение, что эти частицы могут содержать хлоропластные РНК. Факт наличия белка оболочки ВТМ в хлоропластах 5 был также подтвержден Рейнеро и Бичи 0, 1, которые идентифицировали этот белок во фракции хлоропластов из клеток листьев табака, выделенной с помощью центрифугирования в градиенте плотности фи кола. Используя этот же метод очистки хлоропластов центрифугирование в градиенте фикола с последующей обработкой термолизином и РНКазой, Шульц и Цейтлин 8 обнаружили, как они сами пишут, небольшие количества полномерной геномной РНК ВТМ нуклеотидов в хлоропластах табака. Поскольку эта РНК обнаруживалась в хлоропластах и при заражении растений мутантом по белку оболочки в непермиссивных условиях С, когда не происходит формирования вирионов, авторы пришли к выводу, что свободная РНК ВТМ способна проникать в хлоропласты. Более того, поскольку и при заражении Ссштаммом ВТМ в хлоропластах выявлялась только полноразмерная РНК ВТМ, но не короткая РНК, авторы делают вывод, что в хлоропласты проникает только свободная РНК у штамма Сс в отличие от 1 субгеномная способна одеваться белком. ВТМ, причем не с субгеномной РНК, как в цитоплазме, а по аналогии с клетками . РНК. Наиболее чувствительным и доказательным методом выявления вирусспецифических белков и вирусных частиц в органеллах зараженных клеток является метод иммунной электронной микроскопии сверхтонких срезов с последующим декорированием коллоидальным золотом, конъюгированным со стрептококковым белком А. Однако использование этого метода в лаборатории Цейтлина и Доусона 4 не выявило присутствия достоверных количеств белка оболочки ВТМ в хлоропластах как у непосредственно инокулированных, так и системно зараженных ВТМ листьев табака. При этом следует иметь ввиду также и факт иммунологического перекреста между белком оболочки ВТМ и одним из основных белков хлоропластов большой субъединицей рибулозо1,5бифосфаткарбоксилазы . Более того, в работе Линдбека 4 были получены доказательства того, что появление симптомов инфекции как на непосредственно инфицированных, так и на системно зараженных листьях табака никоим образом не связано с проникновением белка оболочки ВТМ внутрь хлоропластов. Взаимодействие с митохондриями. Наиболее известной из работ, посвященных взаимодействию частиц вирусов растений с митохондриями, является опубликованная в году работа Харрисона и Робертса , микрофотографии из которой вошли во многие учебники по вирусологии. Рис. ВПТ типовой представитель группы тобравирусов, наиболее родственной которой является группа тобамовирусов включающая ВТМ.