Некоторые аспекты нерепликативной рекомбинации между фрагментами геномной РНК вируса полиомиелита

• Автор: Белоусов, Евгений Валерьевич
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 167 с. : ил

I 0,5 М подавляет синтез обеих цепей РНК вируса дикого тина, тогда как непермиссивная температура С подавляет синтез только минусцепи мутантного вируса. Если бы гомологичная рекомбинация в данных экспериментах шла согласно нерепликативной модели т. РНК у данных вирусов либо вообще не должно сказываться на частоте рекомбинации, либо должно быть одинаковым при подавлении синтеза РНК обоих вирусов, что не согласуется с полученными данными. Следовательно, рекомбинация зависит от эффективности репликации родительских геномов. Так как низкая частота рекомбинации наблюдалась при подавлении синтеза минус цепи мутантного вируса, авторы сделали вывод, что образование большей части рекомбинантов идет в процессе синтеза минус цепи полноразмерной РНК при репликации вирусного генома. Изменение частоты рекомбинации и характера распределения мест перекреста в экспериментах с использованием мутантного репликативного комплекса вируса мозаики костра V. Во второй половине х годов были получены дополнительные экспериментальные доказательства в пользу репликативного механизма рекомбинации у V . В экспериментах паралельно использовали V дикого типа и варианты V, у которых белки репликативного комплекса содержали различные аминокислотные замены. При этом наблюдали изменение частоты рекомбинации, характера распределения и структуры мест перекреста. Наличие дополнительных нематричных нуклеотидов только в сайтах перекреста говорит о том, что включение данных нуклеотидов произошло непосредственно При образовании рекомбинанта. По мнению авторов, мутантная полимераза на определенных участках начинает проскальзывать, что и приводит к встраиванию нематрнчного нуклеотида или нуклеотидов. При этом пауза в синтезе РНК, в свою очередь, способствует диссоциации полимеразы и смене матрицы. Таким образом, изменение общей частоты рекомбинации, характера распределения и структуры мест перекреста у рекомбинантов при использовании V с мутантным репликативным комплексом говорит о том, что вирусная Iполимераза непосредственно участвует в образовании РНКрекомбинантов. Синтез гетерогенных по длине РНКтранскриптов гомогенными препаратами вирусных РНКполимераз i vi. ДНКпраймеров в качестве затравки РНКполимеразой вируса полиомиелита. Было зарегистрировано образование транскриптов, длина которых превышала длину используемых РНКматриц. Эффективность синтеза удлиненных транскриптов зависела от концентрации РНКматрицы. Следовательно, по мнению авторов, синтез транскриптов данного типа идет за счет удлиннения Зконцевого участка растущей цепи после копирования одной молекулы РНК, при этом, в качестве матрицы используется новая молекула. К аналогичным выводам пришли i Као , которые исследовали i vi эффективность использования РИКпраймеров РНКполимеразами вируса бычьей диареи VV и трех вирусов растений вируса мозаики костра V, вируса мозаики огурца V и вируса хлоротической пятнистости коровьего горошка V. При транскрипции были обнаружены конкатамерные транскрипты, длина которых была кратна длине используемой матрицы ди, три и тетрамеры. Эффективность образования конкатамерных транскриптов зависела от концентрации матрицы и последовательности нуклеотидов на 5концевом участке. Образование таких транскриптов наблюдалось и при использовании РНКматриц, у которых отсутствовали концевой фосфат, 2 и Зконцевые гидроксилы. Следовательно, по мнению авторов, образование конкатамерных транскриптов идет за счет смены матрицы при транскрипции. При этом Зконцевой участок растущей цепи отжигается на 5концевом участоке другой молекулы РНК после завершения синтеза на предыдущей молекуле. Итак, приведенные выше экспериментальные данные говорят о том, что РНКрекомбинация может осуществляется при непосредственном участии вирусной РНКполимсразы в процессе репликации вирусного генома см. Сформулирована следующая последовательность событий. Полимераза начинает репликацию РНК с Зхонца родительской молекулы РНК донорная матрица, затем, по тем или иным причинам, процессивная элонгация цепи приостанавливается.