Разработка методов молекулярной гибридизации и полимеразной цепной реакции для идентификации вируса бешенства

• Автор: Наумкина, Марина Алексеевна
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Покров
• Количество страниц: 132 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
1. ВВЕДЕНИЕ
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Структура генома вируса бешенства
2.2. Антигенные свойства вируса бешенства
2.3 .География распространения бешенства
2.4. Эпизоотическая обстановка по бешенству
2.5. Диагностика бешенства
2.5.1. Диагностические метода, применяемые
для выявления вируса бешенства
2.5.2. Гибридизация
2.5.3. Принцип метода ОТ-ПЦР
2.5.4. Практическое применение метода ПНР
в диагностике бешенства
2.5.5. Альтернативные методы ПЦР
2.6. Филогенетический анализ генома лиссавирусов
2.6.1. Применение филогенетического анализа в
молекулярной эпизоотологии
2.6.2. Полиморфизм гена нуклеопротеина
вируса бешенства
2.6.3. Филогенетический анализ изолятов
первого генотипа вируса бешенства
2.6.4. Полиморфизм РиМгенов
вируса бешенства
2.6.5. Полиморфизм И-Ь генов
вируса бешенства
2.6.6. Сравнительный анализ Ь протеина
Mononegavirales
2.7. Заключение по обзору литературы
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Материалы

3.1.1. Штаммы
3.1.2. Ферменты
3.1.3. Реактивы
3.1.4. Среды
3.1.5. Лабораторное оборудование
3.2. Методы
3.2.1. Очистка вируса бешенства
3.2.2. Фенольно-детергенгный метод выделения РНК
3.2.3. Выделение РНК по Р. Chomezynski и Sacchi
3.2.4.Выделение РНК горячим фенолом
3.2.5. Синтез кДНК и клонирование
3.2.6. Трансформация в Е coli с применением СаС12
3.2.7. Постановка дот-шбридизации
3.2.8. Постановка ОТ-ПЦР
3.2.9. Компьютерный анализ, расчет олигонуклеотидов
4. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
4.1. Очистка вируса бешенства
4.2. Исследование полипептидного состава вируса бешенства
4.3. Результаты отработки методов выделения РНК
4.4. Клонирование фрагментов генома вируса
бешенства в плазмидных векторах
4.5. Исследование экспрессии в клетках
Е coli гена нуклеопротеина
4.6. Разработка «Набора препаратов...» для выявления РНК
вируса бешенства методом дот-габридизации
4.6.1. Конструирование ДНК-зондов, оптимизация
условий проведения дот-габридизации
4.6.2. Определение чувствительности ДНК-зондов для
выявления РНК вируса бешенства
4.6.3. Определение специфичности ДНК-зондов для
выявления РНК вируса бешенства

4.6.4.Исследование динамики накопления вируса бешенства (шт.ТС-80) в культуре клеток почки сайга с
помощью дот-габридизации
4.6.5. Исследование динамики накопления вируса бешенства (шт.ТС-80) в мозге инфицированных мышей
с помощью дот-габридизации
4.6.6. Выявление РНК вируса бешенства в пробах головного мозга инфицированных мышей, хранившихся при
температуре 8° -10° С, с помощью дот-габрщдазации
4.6.7. Выявление РНК вируса бешенства в патологическом
материале с помощью дот-гибридизации
4.7. Разработка «Набора препаратов...» для идентификации вируса
бешенства с помощью ПЦР
4.8. Исследование динамики накопления вируса бешенства (шг. ТС-80)
в культуре клеток почки сайги методом ПЦР
4.9. Исследование динамики накопления вируса бешенства (шт. ТС-80)
в головном мозге инфицированных мышей с помощью ПЦР
4.10. Выявление РНК вируса бешенства в пробах головного мозга инфицированных мышей, хранившихся при
температуре 8° -10° С, с помощью ПЦР
4.11. Выявление РНК вируса бешенства в патологическом
материале с помощью ПЦР
4.12. Дифференциация полевых изолятов от вакцинных штаммов
вируса бешенства
4.13. Дифференциация вакцинных штаммов вируса бешенства
4.14. Стабильность генома вируса бешенства (штамм ТС-80)
при пассировании в культурах клеток ВНК-21 и ПС
5. ОБСУЖДЕНИЕ
6. ВЫВОДЫ
7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
9. ПРИЛОЖЕНИЕ

Рис.З. Филогенетическое дерево лиссавирусов на основе нуклеотидной и аминокислоной последовательностей N-гена и N-белка, соответственно (KissiB., 1995). (слева - на основе нуклеотидной последовательности N гена; справа - на основе аминокислотной последовательности N белка).
Совсем недавно были классифицированы лиссавирусы европейских летучих мышей (Anon, 1995; Bourhy et al, 1992, 1993; Kappeler, A. 1989; King, A. 1988, 1990; Selimov, M. A., 1989, 1990). Amengyal B., et al. провели работу по изучению эволюции этих лиссавирусов (Amengyal., 1997). Были отобраны сорок семь лиссавирусов от Европейских насекомоядных летучих мышей и Африканских насекомоядных летучих мышей для сравнения их эволюционного родства. Исследование было основано на прямом секвенировании ПЦР продуктов - 400 нуклеотидов, кодирующих амино-конец нуклеопротеина. Анализировали как нуклеотидные, так и аминокислотные последовательности этих вирусов, выделенных в три кластера, названных генотип 4, (Duvenhage), генотип 5 (EBL1) и генотип 6 (EBL2). Эволюционный анализ нуклеопротеинового гена генотипов EBL1 и EBL2 выявил низкую внутреннюю гетерогенность, обусловленную, главным образом, синонимическими заменами. Вдобавок, оба генотипа, EBL1 и EBL2, развивались в двух наименее генетически различимых линиях (а и в), следуя географическому дрейфу. Возможно, что эти линии EBLla и EBLIb были занесены в часть северной Европы из двух различных географических направлений: EBLIb, полагают, был внесен совсем недавно из Северной