Выявление вируса простого герпеса и цитомегаловируса в мужских половых клетках при экспериментальной инфекции in vitro и в эякуляте мужчин с нарушениями фертильности

• Автор: Науменко, Виктор Алексеевич
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 161 с. : 21 ил.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ДАННЫХ ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Современные представления о морфогенезе вируса простого герпеса и цитомегаловируса.

1.1. Общая характеристика герпесвирусов.

1.2. Структура вириона.

1.3. Морфогенез.

1.4. Роль сверхраннего белка 1Ерр в морфогенезе

цитомегаловируса

Глава 2. Герпесвирусная инфекция эпидемиологические и патогенетические аспекгы.

2.1. Эпидемиология.

2.2. Клиническая патология.

Глава 3. Общие понятия о сперматогенезе.
3.1. Строение мужских гонад
3.2. Митоз и мейоз в сперматогенезе
3.3. Спермиогенез
3.4. Созревание сперматозоидов в семявьтводящих путях
3.5. Морфология зрелых сперматозоидов
Глава 4. Влияние вируса простого герпеса и цитомегаловируса на сперматогенез.
4.1. Бессимптомное выделение герпесвирусов с эякулятом.
4.2. Роль вируса простого герпеса и цитомегаловируса в развитии бесплодия у мужчин
4.3. Внутригамстная локализация герпесвирусов
4.4. Влияние внутригамстной герпесвирусной инфекции на течение
беременности
4.5. Изучение герпесвирусной инфекции мужских гонад.
4.6. Заключение по обзору данных литературы.
ДАННЫЕ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.
Глава 5. Материалы и методы.
5.1. Пациенты.
5.2. Клинический материал.
5.3. Животные.
5.4. Клеточные культуры.
5.5. Вирусы.
5.6. Определение инфекционной активности вируса простого герпеса и цитомегаловируса
5.7. Спермиологическос обследование.
5.8. Количественное кариологическос исследование
5.9. Быстрый культуральный метод
5 Реакция непрямой иммунофлюоресценции
5 Реакция иммуноисроксидазного окрашивания.
5 Полимеразная цепная реакция.
5 Полимеразная цепная реакции в реальном времени
5 Получение органной культуры мужских половых желез.
5 Заражение органной культуры.
5 Выявление ДНК герпесвирусов и инфекционноактивного вируса в органной культуре.
5 Детекция вирусных белков в органной культуре
5 Гистологический анализ органной культуры
5 Ультраструктурный анализ органной культуры
5 Инфицирование клеток ФЛЭЧ.
5 Иммунофлюоресцентная и конфокальная микроскопия ФЛЭЧ
5 Ультраструктурный анализ ФЛЭЧ.
5 Иммуноэлектронная микроскопия ФЛЭЧ
5 Статистическая обработка
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
Глава 6. Влияние вируса простого герпеса и цитомсгаловируса на фертильность у мужчин
6.1. Частота обнаружения вируса простого герпеса и цитомсгаловируса в эякуляте.
6.2. Выявление вируса простого герпеса и цитомегаловируса в эякуляте мужчин с нарушениями фертильности
6.3. Влияние вируса простого герпеса и цитомегаловируса на основные показатели спермограммы
6.4. Оценка эффективности отмывки сперматозоидов в элиминации герпесвирусов
6.5. Влияние вируса простого герпеса и цитомегаловируса на состав популяции незрелых половых клеток в эякуляте мужчин с нарушениями
фертильности.
Глава 7. Изучение герпесвирусной инфекции мужских гонад i vi
7.1. Получение герпесвирусной инфекции мужских гонад i vi
7.2. Изучение влияния вируса простого герпеса на сперматогенный эпителий i vi
7.3. Выявление вируса простого герпеса и цитомегаловируса в органной культуре мужских гонад
7.4. Изучение цитомегаловирусной инфекции фибробластов i vi при
заражении с низкой множественноегыо инфицирования.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ БОЕ бляшкообразующая единица БКМ быстрый культуральный метод В.ч.мл вирусных частиц в мл ВИЧ вирус иммунодефицита человека ВГВ вирус гепатита В В ГС вирус гепатита С
ВПГ1,2 вирус простого герпеса 1го, 2го типа
ВПГИ ВПГинфекция
ВПЧ вирус папилломы человека
ВРТ вспомогательные репродуктивные технологии
ВЭБ вирус ЭпштейнаБарр
ГВИ герпесвирусная инфекция
ИЭМ иммунноэлектронная микроскопия
МИ множественность инфекции
нИФ непрямая иммунофлюоресценция
НПК незрелые половые клетки
С неподвижные сперматозоиды
ОЯВ околоядерное включение
ПС подвижные сперматозоиды
ПТ плотные тельца
ПЦР полимеразная цепная реакция
ПЦРрв полимеразная ценная реакция в реальном времени
СПИД синдром приобретенного иммунодефицита
ФЛЭЧ фибробласты легкого эмбриона человека
ЦМВ цитомегаловирус
ЦМВИ ЦМВинфекция
ЦГ1Д цитоиатическос действие
ЦЭ цельный эякулят
ЭКО экстракорпоральное оплодотворение
II ИКСИ I i Ii введение сперматозоида в цитоплазму ооцита
I ii v i неинфекционные вирусные частицы с оболочкой
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


А белковым слоем, включающим в себя целый ряд факторов, необходимых для ранних этапов транскрипции вирусных генов, экспрессии сверхранних и ранних вирусных белков, а также для изменения метаболизма инфицированной клетки и преодоления противовирусных механизмов клеточной защиты 5. Вчетвертых, наружную оболочку вириона составляет липидный бислой, на поверхность которого выступают вирусные гликопротеины, отвечающие за проникновение в клетку Рисунок 1. А. Оболочка окончательно формируется при выходе вируса из клетки и может иметь различную форму, иногда она повторяет гексогональную проекцию капсида. Размер вириона ВГ1Г и ЦМВ составляет около нм , 7, 3. В инфицированных герпесвирусами клетках можно наблюдать 3 вида капсидов, отличающихся морфологически Рисунок 2. Скапсиды представляют собой зрелые частицы, содержащие ДНК. В капсидах типа В вместо ДНК находится белок сборки АР, который замещается ДНК в ходе созревания капсида 9. По мнению некоторых авторов, Вкапсиды являются дефектными частицами и не могут трансформироваться в Скапсиды 6, 4. В Акапсидах не содержится ни ДНК, ни матриксного белка. Происхождение Ачастиц связано либо с декапсидацией ДНК Скапсидов, либо с нарушением созревания Вкапсида, при котором потеря матриксного белка не сопровождается инкапсидацией ДНК 8. А. Схема строения вириона герпесвирусов по i Б. Трехмерная реконструкция капсида . IV. Продуктами литической инфекции наряду со зрелыми вирионами являются также неинфекционные вирусные частицы с оболочкой I ii v i и плотные тельца ПТ 8, 6. В отличие от зрелых вирионов I лишены ДНК, т. Вкапсиды, окруженные оболочкой. ПТ не содержат капсида и состоят из вирусных протеинов в основном белков тегумента, окруженных оболочкой. Соотношение числа 1 и ПТ к зрелым вирионам может достигать 1, что свидетельствует об их избыточном синтезе, значение которого для морфогенеза вируса до конца не изучено. По всей видимости, указанные частицы помогают вирусу преодолеть иммунные механизмы защиты 8, 6. I и ПТ не способны вызывать продуктивную инфекцию, однако наличие оболочки позволяет им проникать в клетку, что способствует распространению вирусных антигенов в организме Рисунок 2. Морфогенез всех герпесвирусов протекает по единой схеме Рисунок 3, включающей в себя следующие этапы 1. ДНК 4. ДНК вируса 6. В данном разделе жизненный цикл герпесвирусов представлен на примере ЦМВ. Проникновение вируса в клетку происходит в результате каскада взаимодействий между поверхностными белками вируса и рецепторами клетки. Рисунок 3. Схема морфогенеза цитомегаловируса по Е. Я . Ii, Лг. В 1X дН ддО ЛАХ5 Х дМ. Сборка капсида МСРШвЦ тга л. БСР и4вА рАР Х. На первом этапе поверхностный гликоиротеин В связывается с гетсрополисахаридом клетки гепаринсульфатом, тем самым инициируя взаимодействие вируса с клеточной поверхностью 7. Для адгезии вирусной частицы на клеточной поверхности необходимо последующее взаимодействие с негепариновым рецептором. В процессе проникновения в клетку участвует также белок ЦМВ. Слияние вирусной оболочки с клеточной мембраной и последующее проникновение вируса в клетку происходят после взаимодействия гетероолигомерного III комплекса, состоящего из , с дополнительными клеточными рецепторами, которые в настоящее момент еще не идентифицированы. Обсуждается также участие гстеродимерного комплекса II в проникновении вируса в клетку 3,2. При участии продуктов генов , и иуклсокапсид транспортируется к ядерным порам по системе микротрубочек и вирусная ДНК попадает в ядро. Уже через 1 час белки и ДНК вируса могут быть обнаружены в ядре 7, 4. ДНК вируса становится траискрипционно активной только при проникновении в ядро клетки , 8, 4. Первыми синтезируются, так называемые, сверхранние Iiгены ii, или а транскрипты, и соответствующие им белки. Экспрессия Iгенов ЦМВ инициируется в течение 1го часа после проникновения вируса в клетку. Этот процесс требует синтеза белков v и происходит с участием клеточной РНКполимеразы II. Среди генов, кодирующих Iбелки, наиболее полно охарактеризован главный Iлокус I 2 и 3. Промотор главного мажорного Iгсна I обладает относительно высокой активностью, что является следствием высокого содержания нуклеотидных последовательностей, связывающих факторы транскрипции 7, 8, 4.