Изучение возможности интраназальной иммунизации против клещевого энцефалита

• Автор: Гончарова, Елена Павловна
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Кольцово
• Количество страниц: 131 с. : ил.

1.1. Вирус клещевого энцефалита

1.1.1. Строение вириона

1.1.2. Структура генома

1.1.3. Патогенетические характеристики вируса КЭ

1.2. Механизм нейроинвазии энцефалитогенных вирусов в

1.3. Интраназальная иммунизация

1.4. Рекомбинантные вирусные векторные системы

1.4.1. Рекомбинантные вирусы осповакцины

1.5. Химерные вирусные векторные системы

1.6. ДНКиммунизация

1.7. Не реплицирующиеся векторные системы

1.8. Заключение по обзору литературы ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Исходные материалы
2.1.1. Материалы и реактивы
2.1.2. Антитела к белку Е вируса КЭ
2.1.3. Рекомбинантные белки
2.1.4. Рекомбинантные штаммы ВОВ
2.1.5. Вирусоподобные частицы и плазмиды
2.1.6. Липосомальные и эмульсионные конструкции
2.1.7. Животные
2.1.8. Вирусные препараты
2.1.8.1. Вирус клещевого энцефалита
2.1.8.2. Рекомбинантные штаммы вируса осповакцины и родительские
штаммы ВОВ
2.1.9. Препараты катионных липосом и микрочастиц
2.1 Препараты искусственных вирусоподобных частиц
2.2 Основные методы
2.2.1. Иммунизация животных
2.2.2. Заражение животных и определение протективности иммунного ответа
2.2.3. Подготовка образцов вирусологических, патоморфологических, иммунологических исследований и ОТПЦРанализа
2.2.4. Определение гемоглобина в пробах органов
2.2.5. Определение уровня специфических антител в сыворотках и смывах методом ИФА
2.2.6. Выявление РНК вируса КЭ в пробах органов и крови методом ОТПЦР
2.2.7. Реакция торможения гемагглютинации
2.2.8. Реакция нейтрализации
2.2.9. Определение экспрессии белка Е вируса КЭ в пробах
2.2 Транзиснтная трансфекция плазмид в клеточные линии СОБ1, Уего
и СПЭВ
2.2 Статистическая обработка результатов
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Вирусологические исследования
3.1.1. Изучение распределения и накопления вируса КЭ в органах мышей линии ВАЬВс при интраперитонеальном инфицировании
3.1.1.1. Изучение динамики накопления вируса КЭ
3.1.1.2. Определение вирусной РНК с помощью ОТПЦР анализа
3.1.2. Морфологическое исследование ткани головного мозга экспериментальных животных, зараженных вирусом КЭ
3.1.3. Изучение распределения и накопления родительских и рекомбинантных штаммов ВОВ в органах мышей линии В при
интраназальном инфицировании
3.2. Изучение иммунного ответа при интраназальном применении вирусных векторных систем
3.2.1. Оценка функциональной активности сывороточных антител иммунных животных для вируса КЭ методом ИФА
3.2.2. Соотношение II
3.2.3. Оценка функциональной активности сывороточных антител иммунных животных для вируса КЭ в реакции РТГА и
3.2.4. Изучение протективных свойств рекомбинантных штаммов ВОВ . Изучение иммунного ответа при интраназальном применении не реплицирующихся систем доставки и ДНКвакцин
3.3.1. Изучение систем доставки ВПЧ и липосомы i vi
3.3.2. Изучение специфического гуморального иммунного ответа после интраназальной иммунизации мышей конструкциями ВПЧ и липосом
3.3.3. Изучение протективных свойств конструкций ВПЧ, содержащих плазмидную ДИК
3.3.4. Оценка функциональной активности антител иммунных животных для вируса КЭ методом ИФА после интраназальной иммунизации мышей катионными микрочастицами, содержащими очищенный инактивированный
3.3.5. Оценка функциональной активности сывороточных антител иммунных животных для вируса КЭ в реакции РТГА и
3.3.6. Соотношение 1вС2а
3.3.7. Изучение лротективных свойств препаратов катионных микрочастиц, содержащих очищенный инактивированный вирус КЭ, после интраназальной иммунизации мышей
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
Список литературы


В последнее десятилетие эпидемиологическая ситуация в Новосибирской области продолжает неуклонно ухудшаться, несмотря на активную иммунопрофилактику этого заболевания. Показатель заболеваемости КЭ в тых годах составил ,9 человек на 0 тыс. России в разные годы в 3,,5 раза Кузнецова и др. Летальность от КЭ в разные годы в Новосибирской области варьировала от 1,Здо 6,2. Поэтому разработка новых подходов для профилактики и лечения этого заболевания имеет большое социальное значение. Знание механизмов развития патогенетического процесса дает новые возможности в создании антивирусных препаратов и разработке новых способов иммунопрофилактики и лечения КЭ. Ранние стадии развития клещевого энцефалита остаются во многом неисследованными. Работы, посвященные изучению этого вопроса, полны противоречивых данных. Они не позволяют однозначно описать самый важный этап распространение вируса КЭ в центральную нервную систему ЦНС, что во многом определяет течение и исход болезни. Основным средством активной иммунопрофилактики клещевого энцефалита является вакцина, содержащая инактивированный вирус КЭ, наработанный на культуре клеток куриных фибробластов. В последние десять лет интраназальный способ иммунизации привлекает значительное внимание как потенциальный способ доставки вакцин Рагббоз, . Изучение интраназального способа введения различных вакцин на модельных животных выявило преимущества интраназальной иммунизации доступность места иммунизации, защиту вакцин от протеолитической деградации и индукцию не только мукозального, но и системного иммунного ответа Гсндон, . Интраназальная иммунизация против КЭ с использованием наиболее эффективных систем доставки позволила бы использовать все преимущества мукозальных вакцин для индукции эффективного иммунитета. Актуальность, своевременность и практическая значимость исследуемой проблемы интраназальной иммунизации против вируса КЭ, связана с получением новых знаний о развитии инфекционного процесса КЭ, с возможностью использования этой информации для поиска и оценки новых вакцинных препаратов, способных не только блокировать репликацию вируса в висцеральных органах, но и предотвратить проникновение вируса в головной мозг. Несомненную практическую ценность имеет исследование эффективности различных систем доставки при интраназальной иммунизации против КЭ. Исследование эффективности интраназальной иммунизации для вируса КЭ, типичного представителя семейства флавивирусов, может иметь актуальное значение для других эпидемиологически значимых флавивирусов, таких как вирусы Денге, Японского энцефалита, желтой лихорадки, Западного Нила. Цель работы и основные моменты ее достижения. КЭ вирусоподобными частицами ВПЧ. Для исследования эффективности интраназальной иммунизации были выбраны следующие конструкции 1 два штамма рекомбинантного вируса осповакцины ОВ со встройкой генов структурных С, ргМ, Е и неструктурных I, 2, 2, 3 белков вируса КЭ, 2 вирусоподобные частицы и липосоматьные конструкции, содержащие плазмиды со встроенными генами белков ргМ, Е вируса КЭ, 3 катионные микрочастицы, содержащие очищенный инактивированный вирус КЭ. КЭ, и вирусоподобными частицами, содержащими плазмиды со встроенными генами белков ргМ, Е вируса КЭ, при внутрибрюшинном заражении мышей вирусом КЭ. Большинство из запланированных этапов работы являлись новыми в исследуемой области. Интраназальная иммунизация против нейротропных инфекций, передающихся кровососущими насекомыми, никогда еще не проводилась. Однако, сложившиеся предпосылки, основанные на существовании олфакторного способа распространения в головной мозг других нейротропных вирусов, позволяли надеяться на успех работы. Научная новизна и практическая значимость. В результате проделанной работы было проведено исследование накопления и распределения вируса КЭ на начальных стадиях развития инфекционного процесса при внутрибрюшинном заражении мышей. Впервые показано размножение вируса КЭ в верхних отделах дыхательного тракта мышей после внутрибрюшинного заражения животных вирусом. Проведено исследование накопления четырех штаммов вируса осповакцины в тканях мышей при интраназалыюм заражении животных.